The influence of glucocorticoids on osteoblast-derived factors and their impact on metabolism

Abstract

Numerous severe side effects of GC treatment have been recognised for years. However, the precise molecular mechanisms through which GC exhibit their unwanted actions remain to be determined. More preclinical research is needed to further understand the molecular mechanisms and hormonal interactions leading to GC-induced side effects. One approach taken in this study was to examine the involvement of osteoblasts and their factors, with particular focus on OCN, in relation to metabolic adverse effects. This was based on recent findings by Karsenty et al. who suggest the skeleton to play a major role in the regulation of energy metabolism. The administration of exogenous GC profoundly suppresses osteoblast activity and function resulting in bone loss mostly due to less bone remodelling. Glucocorticoids also diminish the production and secretion of osteocalcin an osteoblastic peptide, which has been shown to be involved in the regulation of fuel metabolism via an endocrine pathway. A well-established tg mouse model was employed in which intracellular GC-signalling was disrupted exclusively in mature osteoblasts and osteocytes through tg overexpression of 11 ß–hydroxysteroid dehydrogenase type 2 (11 ßHSD2) under the control of a collagen type Ia1 promoter (Col2.3–11ßHSD2). Insulin resistance and defective glucose metabolism was detected as early as seven days after the initial GC treatment in WT animals, though not in transgenic animals. Gonadal fat depots and total body fat mass determined at sacrifice showed a significant increase in GC-treated WT animals compared to their equally treated tg littermates (p < 0.01). Leptin levels were elevated by GC treatment in WT and tg mice, however they were unaffected by genotype at all time-points, displaying a well known GC action independent of osteoblast function. Insulin concentrations were raised due to GC administration although not significantly different between WT and tg mice at day 7. Adiponectin levels were increased in all treated animals at all time- points, yet showed a significant increase at day 21 in tg GC-treated animals compared to their WT littermates. Osteocalcin concentrations were reduced by GC treatment as expected. These results support the hypothesis that the osteoblasts and their products are involved in the regulation of energy metabolism in animals treated with GC. It can be concluded that leptin is not affected by the osteoblast or its products, whereas adiponectin seems to be involved in the complex interaction between GC, osteocalcin and the onset of insulin resistance and glucose intolerance as well as fat accrual. To further examine the role of osteocalcin and confirm its involvement in the complex interaction of metabolic players a separate method was established to re- introduce OCN into the circulation and therefore elevate OCN serum levels. Hydrodynamic tail vein injection is a method through which plasmid DNA containing a gene of interest and a liver-specific promoter can be forced into hepatocytes and their intracellular enzymatic make-up used to produce and secrete OCN into the bloodstream. The method was set up using a yellow fluorescent protein (YFP) in a CMV promoter. The liver sections examined 20 hours after hTVI showed the desired perivenous accumulation of YFP, which was detected via flourescent light microscopy. ITTs performed on WT animals receiving the cloned OCN pLIVE construct showed ameliorated insulin sensitivity compared to WT GC-treated animals receiving the pLIVE control construct at days 7, 14 and 21. Consequently, OCN could be shown to have positive systemic metabolic effects on insulin and glucose handling. Further evidence needs to be obtained to determine if the pharmacological elevation of OCN concentrations could be considered as a possible drug target to minimise or completely reverse the GC-induced side effects and therefore use the otherwise highly effective anti-inflammatory actions of GC to its full extend. The application of OCN as a preventative drug to GC-induced adverse effects or as a possible treatment option for diabetic conditions would provide great relief to all patients suffering from the detrimental effects on health and lifestyle resulting in metabolic changes the body undergoes when treatment with GC becomes necessary or T2DM is apparent.

Nach langjährigem erfolgreichen therapeutischem Einsatz von Glukokortikoiden (GC) zur Therapie von zahlreichen chronisch entzündlichen Krankheitsbildern, bleiben die vielen muskuloskeletalen und metabolischen Nebenwirkungen (NW) ein limitierender Faktor für eine suffiziente Langzeittherapie. Auch heute noch, sind nicht alle molekularen Mechanismen vollständig verstanden, durch welche GC zu unerwünschten NW führen. GC supprimieren die Funktionalität von Osteoblasten und führen zu einer verminderten Sekretion von Osteocalcin. Möglicherweise beeinflusst das von den Osteoblasten produzierte Peptid die Regulation des Energiestoffwechsels über einen endokrinen Rückkopplungsmechanismus. In dieser Studie wurde ein bewährtes Mausmodell genutzt, in welchem durch die transgene Überexpression des Enzyms 11ß–Hydroxysteroid Dehydrogenase Typ 2 (11ß-HSD2) unter der Kontrolle des Kollagen Typ 1 Promoters (Col2.3–11ß-HSD2) der Glukokortikoidsignalweg im Osteoblasten erfolgreich in vivo blockiert wurde. Die Behandlung mit 1.5mg Kortikosteron erfolgte an 8 Wochen alten männlichen transgenen (n=48) und Wildtyp Mäusen (n=48). Es wurden zu verschiedenen Zeitpunkten Insulin Toleranz Tests und orale Glukose Toleranz Tests durchgeführt und verschiedene metabolisch aktive Hormone wie Insulin, Leptin, Adiponectin und Osteocalcin (OCN) gemessen, sowie die Ganzkörperfettmasse der Tiere nach 4 Wochen. Während der ersten 7 Tage konnte eine beginnende Insulinresistenz und eine gestörte Glukosetoleranz in den behandelten Wildtyp Mäusen nachgewiesen werden. Die transgenen Tiere hingegen blieben insulinsensitiv und waren in der Lage Glukose nach oraler Applikation zeitgerecht aus dem Blutkreislauf zu eliminieren. Nach 4 Wochen hochdosierter Kortikosterontherapie konnte bei den Wildtyp Mäusen ein signifikant vergrößertes viszerales Fettdepot und eine erhöhte Gesamtfettmasse im Vergleich zu den transgenen Mäusen festgestellt werden (p<0.01). Die Leptin Blutkonzentrationen wurden durch die Gabe von Glukokortikoiden stark erhöht, allerdings konnte kein signifikanter Unterschied an allen untersuchten Zeitpunkten zwischen den Genotypen erkannt werden. Weiterhin war in allen mit Kortikosteron therapierten Tieren die Adiponectinkonzentrationen ebenfalls erhöht. An Tag 21 wurde ein signifikanter Unterschied der Adiponectinkonzentrationen zwischen transgenen und Wildtyp Mäusen gemessen (p<0.05). Wie erwartet führte die Verabreichung von GC zu einer starken Verminderung der Osteocalcinkonzentration. Insgesamt weisen die vorliegenden Ergebnisse daraufhin, dass die auftretenden metabolischen NW bei GC Gabe zum Teil durch den Osteoblasten bzw. dessen sezernierte Faktoren, wie Osteocalcin, vermittelt werden. Es lässt sich schlussfolgern, das Leptin nicht von dieser Ereigniskaskade beeinflusst wird, hingegen ist es wahrscheinlich, dass die Adiponectinkonzentrationen, welche möglicherweise von den OCN- Konzentrationen reguliert werden, an der Entstehung von Insulinresistenz und Glucoseintoleranz beteiligt sind. Damit eine genauere Einschätzung der möglichen Beteiligung von OCN stattfinden konnte, wurde eine Gentherapiemethode etabliert, um OCN-Konzentrationen in vivo zu erhöhen. Die hydrodynamische Schwanzveneninjektion ist eine Methode mittels welcher Plasmid DNA in den Hepatozyten angereichert wird und das zelluläre Enzymsystem das entsprechende Peptid produziert und sezerniert. Diese physikalische Methode wurde mit Hilfe eines gelb fluoreszierenden Proteins (YFP) in einem CMV Promotor erprobt und die gewünschte paravenöse Anreicherung des YFP in der Leber nach 20h gesichert. Anschließend wurden die hTVI mit OCN Plasmiden und Placebo an GC behandelten Tieren durchgeführt. Die ITTs zeigten eine Verbesserung der Insulinsensitivität in den Tieren, die im Vergleich zu den Mäusen mit Placeboinjektionen OCN erhalten haben. Weitere Studien sind nötig um zu evaluieren, ob OCN möglicherweise effizient und potent genug wäre, den glukokortikoiden metabolischen NW vorzubeugen oder diese möglicherweise zu therapieren, damit die hocheffektiven anti–inflammatorischen Wirkungen von Glukokortikoiden genutzt werden können. Die Möglichkeit eines Therapeutikums zur Vorbeugung von glukokortikoid-induzierten metabolischen NW und möglicherweise sogar zur Behandlung von Diabetes mellitus Typ 2 würde eine Erleichterung für die betroffenen Patienten und eine enorme Verbesserung der eingeschränkten Lebensqualität darstellen.