A Structural View on Mechanisms of Bacterial Communal Life and Toxicity

Abstract

Nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) is a versatile tool that can be applied to study the structure of biological systems both in solution and solids. These two approaches complement each other, particularly regarding proteins that can assemble into complexes of different sizes. The focus of this work is set on two bacterial proteins: (i) TasA, which is expressed by Bacillus subtilis and a vital component of its biofilm, and (ii) TcHVR, a toxic enzyme produced by Photorhabdus luminescens as part of its toxin complex (Tc). Various bacteria form biofilms with proteinaceous elements, which are often of amyloid nature, and for B. subtilis, this main protein component is TasA. Extensive studies have been conducted on this protein, with different forms being described, and a monomeric structure of the protein was recently solved using X-ray crystallography. However, NMR, Electron microscopy (EM), and other biophysical methods have shown that TasA converts into a filamentous form and not an amyloid-like state within the biofilm environment. Here, the structure of the filamentous form of TasA was analyzed using solid–state magic angle spinning (MAS) NMR. Through 1H-detected experiments, an assignment of 87 % of all backbone NMR signals could be reached. The obtained chemical shifts facilitated the determination of dihedral angles and local secondary structure. Notably, the majority of structural elements of the monomeric structure is retained after the transition to filaments, but significant rearrangements happen at the termini. Most conformational changes occur in the N-terminal region, as confirmed by NMR experiments yielding through-space contacts. In this region, the observed signals pointed towards hydrogen bonding patterns typically found in anti-parallel β-sheets. By preparing filaments by mixing two differently labeled samples, it could be confirmed that these anti-parallel contacts result from inter-molecular interactions. In detail, the N terminus constitutes a newly formed strand β0 that is present exclusively in the filamentous form of TasA. β0 runs anti-parallel to β9 of an adjacent TasA molecule, creating the observed inter-molecular contact. The N-terminal rearrangement also explains the mechanism by which TapA, an accessory protein of TasA, is able to accelerate filament formation. The N terminus of TapA is homologous to that of TasA and can form a similar β0-strand which stimulates filament formation of adjacent TasA molecules. The observed inter-molecular interaction pattern is characteristic of a polymerization mechanism called ‘donor-strand exchange’, prominently known for its role in the generation of type I pili by gram-negative bacteria. The diverse range of organisms (e.g., Escherichia coli, Acinetobacter baumannii, and Pseudomonas aeruginosa) employing donor-strand exchange for biofilm formation indicates the potency of this mechanism. Understanding its impact on bacterial assemblies holds promise for selected biofilm control, either to combat bacterial infection or in plant protection. Toxin complexes (Tc) are utilized by various bacteria to kill targeted cells. Their toxicity mechanism involves multiple steps: the initial translocation of a toxic enzyme into the target cell by a large assembly (the Tc) and the subsequent covalent modification of its target molecule, often actin, by the small toxic enzyme itself. In the context of P. luminescens, the proteins TcdA1, TcdB2, and TccC3 assemble to form a full Tc. This work focuses on a subcomplex formed by TcdB2 and TccC3 (TcB-TcC), which contains the toxic enzyme (referred to as TcHVR). The TcHVR sequence is located at the C-terminal end of TccC3 and, after assembly of the TcB-TcC complex, gets autoproteolytically cleaved and rests inside a shell formed by TcB-TcC until it is injected. The full Tc has been extensively characterized using various methods, particularly cryo-EM, which focused on the conformational rearrangements needed for proper translocation. The structures and functions of the Tc components are well-known, but the precise conformation of the small TcHVR remained elusive. To address this, we employed solid–state and solution NMR techniques to investigate TcHVR, aiming at a model of the enzyme inside TcB-TcC and after translocation. Specifically, we aimed at determining the folding state of TcHVR inside the TcB-TcC complex and the molecular basis of its toxicity when within the targeted cell. Investigating TcHVR by solution NMR, a resonance assignment rate of over 91 % of all NMR-active nuclei was achieved. The determined chemical shifts allowed for an analysis of the secondary structure patterns and, based on NOESY data of molecular contacts, the calculation of a structure ensemble. Certain regions of the enzyme, particularly the section adjacent to the binding pocket, exhibited characteristics typical of an ADP-ribosyltransferase. Chemical shift perturbations demonstrated that TcHVR binds to its cofactor, NAD+, in a manner similar to known ADP-ribosyltransferases. Moreover, cryo-EM analysis of the F-actin bound state, combined with relaxation measurements performed by NMR, indicated significant changes in the NAD+ pocket during the binding process. A flexible loop comprised of TcHVR residues 198-208 rearranges to accommodate NAD+, and an ionic interaction between K185 and E265 controls the access to the cofactor pocket. By docking NAD+ into the cryo-EM structure, we successfully modeled the intermediate ligand-bound state. Consequently, the findings obtained by NMR, cryo-EM, and modeling elucidate the entire process of ligand binding, conformational changes, and catalysis mechanism of the ribosylation reaction inside the target cell. The structure ensemble obtained for free TcHVR allowed us to analyze its state within the TcB-TcC subcomplex. We acquired a spectrum of TcHVR inside the TcB-TcC complex by employing ultra-fast MAS at frequencies exceeding 100 kHz. The estimation of signal completeness by analyzing the arginine region of the spectrum showed that signals of TcHVR are observable. By comparing the spectra of TcHVR inside TcB-TcC and the enzyme alone, we found that peaks from residues in the hydrophobic core of folded TcHVR are absent in the TcB-TcC spectrum. From their absence, we deduce that the hydrophobic core of TcHVR does not form when it is inside the shell. The lack of this distinct environment indicates that TcHVR remains unfolded and only adopts its functional state after translocation into the targeted cell.

Die Kernspinresonanzspektroskopie (engl.: ‚Nuclear Magnetic Resonance‘, NMR) ist eine vielseitige Methode, die zur Untersuchung der Struktur biologischer Systeme genutzt werden kann. Dabei ist es möglich, NMR sowohl in Lösung als auch im festen Zustand (Festkörper-NMR) anzuwenden, wobei beide Ansätze sich ergänzende Erkenntnisse liefern. Dies ist insbesondere bei Proteinen hilfreich, welche sich zu Komplexen unterschiedlicher Größe zusammenschließen können. Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf zwei bakteriellen Proteinen, die genau das tun: (i) TasA, welches von Bacillus subtilis exprimiert wird und ein wichtiger Bestandteil seines Biofilms ist, und (ii) TcHVR, ein toxisches Enzym, das von Photorhabdus luminescens als Teil seines Toxinkomplexes (engl.: ‚toxin complex‘, Tc) produziert wird. Eine große Anzahl an Bakterien bilden Biofilme, in die Proteine als wichtige Bestandteile eingebaut werden. Oft bilden diese dort strukturgebende Amyloide aus. Bei dem Bakterium B. subtilis übernimmt diese Rolle das Protein TasA. Bezüglich TasA wurden umfangreiche Studien durchgeführt, wobei verschiedene Formen beschrieben wurden, darunter auch eine amyloide. Außerdem konnte vor kurzem eine monomere Struktur des Proteins mit Hilfe von Röntgenkristallographie gelöst werden. Jedoch haben NMR, Elektronenmikroskopie (EM) und andere biophysikalische Methoden gezeigt, dass TasA in der Biofilmumgebung weder einen monomeren noch einen amyloidartigen Zustand annimmt, sondern vielmehr eine filamentöse Form. In dieser Arbeit wurde die Struktur der filamentösen Form von TasA mit Hilfe der Festkörper-NMR analysiert. Hierbei wird die Probe um den magischen Winkel von 54,7° gedreht, weswegen man von MAS (engl.: ‚Magic Angle Spinning‘) NMR spricht. Mithilfe von 1H-detektierten Experimenten konnten 87 % der Atome des Proteinrückgrats ein NMR-Signal zugeordnet werden. Die dadurch erhaltenen chemischen Verschiebungen ermöglichten die Bestimmung von Torsionswinkeln des Rückgrats und der lokalen Sekundärstruktur. Dabei konnte festgestellt werden, dass die meisten Sekundärelemente der monomeren Struktur nach dem Übergang zu Filamenten unverändert bleiben. Allerdings deuteten die Daten auf erhebliche Umlagerungen an den beiden Enden der Proteinsequenz hin. Dabei finden die meisten konformationellen Änderungen in der Region des N-Terminus statt, was durch Raumkontakte in dafür aufgenommenen NMR- Experimenten bestätigt werden konnte. In diesem Bereich wiesen die beobachteten Signale auf Wasserstoffbrücken hin, die typischerweise in antiparallelen β-Faltblättern zu finden sind. Durch die Nutzung von unterschiedlichen Markierungsmustern in der Herstellung der Filamente konnte gezeigt werden, dass diese antiparallelen Kontakte aus intermolekularen Wechselwirkungen resultieren. Im Detail betrachtet bildet der N-Terminus einen neuen Strang β0 aus, der ausschließlich in der filamentösen Form von TasA vorhanden ist. Der Strang β0 verläuft antiparallel zu dem Strang β9 eines benachbarten TasA-Moleküls, wodurch der beobachtete intermolekulare Kontakt entsteht. Die N-terminale Umstrukturierung erklärt auch den Mechanismus, durch welchen TapA, ein Hilfsprotein von TasA, die Filamentbildung beschleunigen kann. Der N-Terminus von TapA ist homolog zu jenem von TasA und kann einen ähnlichen β0-Strang bilden, der in gleichem Maße die Bildung von Filamenten von TasA-Molekülen induziert. Das beobachtete intermolekulare Interaktionsmuster ist charakteristisch für einen Polymerisationsmechanismus, der als ‚Donor-Strang-Austausch‘ bezeichnet wird und vor allem für seine Rolle bei der Bildung von Typ-I-Pili durch gram-negative Bakterien bekannt ist. Die große Vielfalt der Organismen (z.B. Escherichia coli, Acinetobacter baumannii und Pseudomonas aeruginosa), die den Donor-Strang-Austausch für die Biofilmbildung nutzen, zeigt, wie effizient dieser Mechanismus sein muss. Ein besseres Verständnis des Donor-Strang-Austauschs sowie seiner Rolle in bakteriellen Kolonien ermöglicht eine gezielte Manipulation von Biofilmen, entweder zur Bekämpfung von Infektionen oder im Pflanzenschutz. Toxinkomplexe (Tc) werden von vielen Bakterien genutzt, um ausgewählte Zielzellen zu töten. Der Mechanismus, mit dem diese Toxine agieren, besitzt zwei entscheidende Schritte: die anfängliche Injektion eines toxischen Enzyms in die Zielzelle durch ein großes Protein (den Tc) und die anschließende kovalente Veränderung des Zielmoleküls in der Zelle. Die Modifikation des Ziels wird durch das toxische Enzym herbeigeführt, welches vorher ein Teil des Tc war. Bei den Tc von P. luminescens formen die Untereinheiten TcdA1, TcdB2 und TccC3 einen vollständigen Komplex. In dieser Arbeit liegt der Fokus auf einem Unterkomplex, der lediglich von TcdB2 und TccC3 (TcB-TcC) gebildet wird und das toxische Enzym TcHVR enthält. TcHVR befindet sich am C-terminalen Ende der TccC3-Sequenz, wird nach der Bildung des TcB-TcC Komplexes autoproteolytisch abgespalten und ruht danach in einer von TcB-TcC gebildeten Hülle, bis es injiziert wird. Der vollständige Tc wurde zuvor mit verschiedenen Methoden, insbesondere der Kryo-EM, umfassend charakterisiert. Dabei lag der Schwerpunkt auf lokalen Konformationsänderungen, welche für eine ordnungsgemäße Injektion des TcHVRs erforderlich sind. Die Strukturen und Funktionen der Tc-Komponenten sind daher bekannt, der genaue Zustand des kleinen Enzyms TcHVR ist jedoch noch unklar. Wir haben Festkörper- und Lösungs-NMR-Techniken eingesetzt, mit dem Ziel, ein Modell des Enzyms innerhalb des TcB-TcC Komplexes, sowie nach der Injektion zu erstellen. Insbesondere der Faltungszustand von TcHVR innerhalb der TcB-TcC-Hülle und die molekulare Grundlage seiner Toxizität in der Zielzelle sollten bestimmt werden. Bei der Untersuchung des TcHVRs mittels Lösungs-NMR wurden über 91 % aller NMR-aktiven Kerne ihren chemischen Verschiebungen zugeordnet. Die Zuordnung ermöglichte eine Analyse der lokalen Sekundärstrukturmuster und, basierend auf Informationen aus NOESY-Spektren über Molekülkontakte, die Berechnung einer Strukturschar. Bestimmte Bereiche des Enzyms wiesen typische Faltungsmuster einer ADP-Ribosyltransferase auf. Diese Charakteristik war insbesondere in der Region, welche der Bindungstasche angrenzt, stark ausgeprägt. Gemessene Änderungen der chemischen Verschiebung nach Titration mit dem Kofakor NAD+ zeigten, dass TcHVR diesen auf ähnliche Weise wie bekannte ADP-Ribosyltransferasen bindet. Darüber hinaus wies eine Kryo-EM-Untersuchung des an F-Aktin gebundenen TcHVRs, in Kombination mit NMR-Daten, auf signifikante Veränderungen in der NAD+-Bindungstasche während des Assoziationsprozesses hin. Ein flexibler Loop, der aus den Resten 198-208 des TcHVRs besteht, ändert seine Orientierung, um NAD+ binden zu können. Außerdem liegt eine Ladungswechselwirkung zwischen K185 und E265 vor, welche den Zugang zur Bindungstasche kontrolliert und vor dem Andocken des Liganden gelöst werden muss. Durch eine Simulation der Position von NAD+ in der Kryo-EM-Struktur konnten wir den Zustand von TcHVR mit gebundenem Liganden erfolgreich modellieren. Die durch NMR, Kryo-EM und computergestützte Simulation gewonnenen Erkenntnisse zeigen gemeinsam den Prozess der Ligandenbindung, der Konformationsänderungen und des Katalysemechanismus der Ribosylierung innerhalb der Zielzelle. Die für das freie TcHVR erhaltene Strukturschar ermöglichte es uns, seinen Zustand innerhalb des TcB-TcC-Unterkomplexes zu untersuchen. Dafür haben wir ein Festkörper-NMR Spektrum des TcB-TcC-Komplexes mit dem darin enthaltenen TcHVR aufgenommen. Dabei wurde die Probe bei hohen MAS-Frequenzen von über 100 kHz vermessen, um 1H-detektierte Experimente aufnehmen zu können. Die Vollständigkeit der Signale im Spektrum wurde durch eine Analyse des Argininbereichs des Spektrums abgeschätzt. Dadurch zeigte sich, dass die Signale des TcHVRs enthalten sein müssen. Mithilfe eines Vergleiches der Spektren von TcHVR im TcB-TcC-Komplex und des Enzyms allein konnten wir feststellen, dass die Signale der Aminosäuren aus dem hydrophoben Kern des gefalteten TcHVR im Komplex fehlen. Daraus schließen wir, dass sich der hydrophobe Kern des TcHVR innerhalb des Komplexes nicht bildet. Das Fehlen dieser besonderen Umgebung innerhalb des Proteins deutet darauf hin, dass das TcHVR ungefaltet bleibt und erst nach der Injektion in die Zielzelle seinen funktionellen Zustand annimmt.