Untersuchungen zur antineoplastischen Wirkung neuartiger HDAC-Inhibitoren bei Prostata- und hepatozellulären Karzinomen

Abstract

Die neu entwickelten Substanzen 3BrQuin-SAHA, 3ClQuin-SAHA, zwei chimäre EGFR/HDAC-Inhibitoren, und SF5-SAHA, ein HDAC-Inhibitor, wurden in ihrer Wirkung und Wirkmechanismen an Zellen des Prostata- (PCa) und hepatozellulären (HCC) Karzinoms genauer charakterisiert. Eine Verbesserung der Therapie beider Tumoren-titäten ist, gemessen am Auftreten weltweit letal verlaufender Fälle, klinisch von äu-ßerster Relevanz und anzustreben. In Zellproliferationsversuchen hemmten die neuartigen Inhibitoren das Wachstum von DU145- (PCa) und Hep-G2 (HCC) Zellen im einstelligen mikromolaren Bereich. Als zugrundeliegender Wirkmechanismus für die beobachteten antiproliferativen Effekte der Inhibitoren konnte durch Bestimmung der Laktatdehydrogenase im Überstand un-spezifische Zytotoxizität ausgeschlossen werden und durch Kinase-Assays die Target-spezifische Wirkung der Substanzen belegt werden. 3BrQuin-SAHA und 3ClQuin-SAHA hemmten die Epidermaler Growth Factor Receptor (EGFR)-Kinase in einem vergleichbaren Ausmaß wie der reine EGFR-Inhibitor Gefitinib und alle getesteten Substanzen reduzierten die Histon-Deacetylase (HDAC)-Aktivität ähnlichen stark wie der HDAC-Inhibitor SAHA. Als weiter Marker für einen gezielten Zelluntergang konnte eine Induktion der apoptosespezifischen Caspase-3-Aktivität gemesser werden und eine vermehrte Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies qualitativ bestimmt werden. Western Blot Untersuchungen an DU145 Zellen zeigten eine dosisabhängig gestei-gerte Acetylierung von Histon H3, eine verminderte Expression des EGFR, sowie eine durch Caspase-3 induzierte gesteigerte Spaltung der Poly(ADP-Ribose)-Polymerasen (PARP). Im Scratch-Assay wurde zudem gezeigt, wie 3ClQuin-SAHA und SF5-SAHA die Migration von DU145 Zellen verlangsamt. Weiterführend wurden in vivo die anti-angiogenetischen Effekte der Inhibitoren an der stark vaskularisierten Chorioallanto-ismembran (CAM) evaluiert und aufgezeigt. Die vielversprechenden Ergebnisse legen nahe, dass HDAC-Inhibitoren als Ein-zelsubstanzen oder als duale Inhibitoren in Form von EGFR/HDAC-Chimära eine nä-her zu untersuchende Therapiealternative darstellen und weitere Versuche zum bes-seren Verständnis der Relevanz und Wirkweise von HDAC-Inhibitoren zur Therapie von PCa und HCC anzustreben sind.

The newly developed substances 3BrQuin-SAHA, 3ClQuin-SAHA, two chimeric EGFR/HDAC inhibitors, and SF5-SAHA, an HDAC inhibitor, were characterized in more detail in terms of their effect and mechanisms of action on cells of prostate (PCa) and hepatocellular (HCC) carcinoma. An improvement in the therapy of both tumor types, measured by the incidence of lethal cases worldwide, is clinically of utmost rel-evance and should be strived for. In cell proliferation experiments, the novel inhibitors restrain the growth of DU145 (PCa) and Hep-G2 (HCC) cells in a single-digit micromolar range. The underlying mechanism of action for the observed antiproliferative effects of the inhibitors was ruled out by determination of lactate dehydrogenase in the supernatant and the target-specific effect of the substances was proven by kinase assays. 3BrQuin-SAHA and 3ClQuin-SAHA inhibited epidermal growth factor receptor (EGFR) kinase to a compa-rable extent as the pure EGFR inhibitor gefitinib and all tested substances reduced histone deacetylase (HDAC) activity to a similar extent as the HDAC inhibitor SAHA. As a further marker for targeted cell death, an induction of apoptosis-specific caspase-3 activity was measured, and an increased formation of reactive oxygen species was qualitatively determined. Western blot investigations on DU145 cells showed a dose-dependent increased acetylation of histone H3, a decreased expression of EGFR, as well as an increased cleavage of poly(ADP-ribose) polymerases (PARP) induced by caspase-3. Scratch assays also showed how 3ClQuin-SAHA and SF5-SAHA slow down the migration of DU145 cells. Further, the anti-angiogenic effects of the inhibitors were evaluated and demonstrated in vivo at the highly vascularised chorioallantoic membrane (CAM). The promising results suggest that HDAC inhibitors as single compounds or as dual inhibitors in the form of EGFR/HDAC chimera represent a therapeutic alternative to be investigated further and that further studies to better understand the relevance and mode of action of HDAC inhibitors for the therapy of PCa and HCC should be pursued.