Auswirkungen einer GABA-Rezeptor-Antagonisierung auf die oligodendrogliäre Entwicklung und Myelinisierung am Modell des neonatalen Rattencortex

Abstract

Die (intensiv)medizinischen Behandlungsmöglichkeiten von Früh- und Neugeborenen haben sich in den letzten Dekaden drastisch verbessert. Kommt ein Säugling frühzeitig auf die Welt, ist jedoch seine Gehirnentwicklung nicht vollends abgeschlossen und zudem postnatal externen Einflüssen ausgesetzt. Spezifisch gehen damit Myelinisierungsdefizite, Schädigungen von γ-Aminobuttersäure-(GABAergen) Interneuronen und Veränderungen in der oligodendrogliären Entwicklung einher. Inwieweit diese Prozesse sich gegenseitig bedingen, bleibt weitestgehend ungeklärt. Vorherige Daten zeigten auf, dass Myelin-bildende oligodendrogliäre Zellen GABA-Rezeptoren exprimieren. Ein Einfluss von GABA über diese Rezeptoren auf Oligodendroglia und die Myelinisierung scheint somit denkbar. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Myelinproduktion und die GABA-induzierte Reifung, Proliferation und Apoptose von Oligodendroglia im Gehirn der neonatalen Ratte nach pharmakologischer Blockade der GABAA und GABAB-Rezeptoren zu untersuchen. Vom postnatalen Tag (P) 6 bis P11 wurde der reverse GABAA-Rezeptor-Agonist DMCM oder der GABAB-Rezeptor-Antagonist CGP täglich intraperitoneal injiziert. Die Analysen folgten zu P11 und P15. Western Blots und Immunhistochemie dienten zur Messung der MBP Expression. Weiterhin bestimmten wir mittels immunhistochemischer Färbung zur Evaluation der oligodendrogliären Reifung die Rate der CC1+OLIG2+ und CNP+OLIG2+ Zellen sowie zur Auswertung der Proliferation die Rate der PCNA+OLIG2+ Oligodendroglia. Oligodendrogliäre Vorläuferzellen wurden mit PDGFRα-Antikörpern gefärbt. Ebenso wurde eine Analyse der oligodendrogliären Apoptose (CASP3+OLIG2+) und aller apoptotischen Zellen (CASP3+DAPI+) vorgenommen. Zusätzlich erfolgte die Bestimmung der Pdgfrα Genexpression mittels qPCR und der CNP Proteinexpression via Western Blot. Die MBP-Expression wies eine signifikante Reduktion, insbesondere nach CGP-Behandlung, zum Zeitpunkt P15 auf. Ebenso ergab sich in jener Tiergruppe eine temporäre Absenkung von reifen CNP+ Oligodendrozyten sowie der CNP Proteinexpression im Alter P11. Zu P15 war ein Anstieg der Proliferation von Oligodendroglia (PCNA+OLIG2+), und spezifisch der oligodendrogliären Vorläuferzellen (PDGFRα+OLIG2+), nach GABAB-Rezeptor-Antagonisierung erkennbar. Die Pdgfrα Genexpressionen zeigte sich nach Behandlung unverändert. Gleiches gilt für den apoptotischen Zelltod sowie für Proliferations- und Reifungsuntersuchungen nach GABAA-Rezeptor-Blockade. Unsere in vivo Studie an neugeborenen Ratten deutet darauf hin, dass besonders die GABAB-Rezeptor-Aktivität eine modulierende Funktion in der Oligodendroglia-Entwicklung sowie in der adäquaten Myelinisierung innehält. Daraus schlussfolgernd, spielen GABAB-Rezeptoren eine zentrale Rolle im Verständnis von auf Myelindefiziten basierenden Pathologien und könnten künftig einen vielversprechenden Ansatzpunkt in der Regulierung der Gehirnentwicklung Frühgeborener über die Myelinbildung bieten.

Through (intensive) medical care, treatment possibilities of premature and newborn children have improved drastically during the last decades. However, when a child is born preterm, its brain development is not fully completed yet and is furthermore exposed to postnatal external influences. The specific consequences range from myelination deficits up to impairments of γ-aminobutyric acid-(GABAergic) interneurons and changes in oligodendroglial development. To what extent these processes are mutually dependent, is largely unknown. Prior data has shown that myelin forming oligodendroglial cells express GABA receptors. An impact of GABA via these receptors on oligodendroglia and myelination appears conceivable. In this study, we aimed to examine the myelin production as well as the GABA-induced maturation, proliferation, and apoptosis of oligodendroglia in the brain of neonatal rats after pharmacologically blocking GABAA and GABAB receptors. From postnatal day 6 (P6) to P11, the reverse GABAA receptor agonist (DMCM) or the GABAB receptor antagonist CGP were injected intraperitoneally on a daily basis. This was followed by analysis at P11 and P15. Western blots and immunohistochemistry were performed to determine the expression of MBP. Furthermore, via immunohistochemical stainings, we assessed the rates of CC1+OLIG2+ and CNP+OLIG2+ cells to evaluate maturation and analyzed the rate of PCNA+OLIG2+ oligodendrocytes for proliferation. Oligodendrocyte precursor cells were stained with antibodies to PDGFRα+. An analysis of the oligodendroglial apoptosis (CASP3+OLIG2+) and of apoptotic cells in total (CASP3+DAPI+) was performed. Additionally, we assessed the Pdgfrα gene expression through qPCR and the protein expression of CNP via Western blot. MBP expression showed a significant reduction, especially after treatment with CGP, at P15. Also, the number of mature CNP+ oligodendrocytes and the CNP protein expression and decreased temporarily at P11 in the same animal group. At P15, the proliferation of oligodendroglia (PCNA+OLIG2+), and especially of oligodendrocyte precursor cells (PDGFRα+OLIG2+), increased after antagonization of GABAB receptors. Pdgfrα gene expression remained unaffected after treatment. The same accounts for apoptotic cell death and all examinations of proliferation and maturation after GABAA receptor blockade. Our in vivo study in neonatal rats indicates that especially GABAB receptor activity fulfills a modulating role concerning oligodendroglial development and adequate myelination. As a conclusion, GABAB receptors play a key role in the understanding of pathologies caused by myelin deficits and could offer a promising approach in the regulation of the brain development among preterm children via their myelin synthesis.