Klonierung und funktionelle Analyse der 5'-flankierenden Region des humanen kardialen ERα-Gens

Abstract

Die Östrogene üben ihre Wirkung überwiegend durch die Aktivierung der Östrogenrezeptoren ERalpha und ERbeta aus. Die Transkription des humanen ERalpha-Gens kann von sieben verschiedenen Promotoren (A, B, C, D, E, F und T) initiiert werden, deren Transkripte sich alle in der 5’-UTR unterscheiden. Diese Promotoren werden zell- und gewebespezifisch exprimiert. Um die transkriptionelle Regulation des hERalpha-Gens im humanen Myokard zu untersuchen, wurden zunächst die alternativen 5’-UTR-Varianten des hERalpha- Gens mittels 5’-RACE, PCR und semiquantitativer PCR identifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass die ERalpha-mRNA von den Promotoren A, B, C und F transkribiert werden, von denen der F-Promotor die dominante Variante ist. Für die funktionellen in vitro-Studien in der humanen Kardiomyozyten-Zelllinie AC16 wurden Teilbereiche der verschiedenen Promotorsequenzen der vier identifizierten Promotoren amplifiziert und in das pGL2-basic-Luciferase- Reporter-Plasmid kloniert. Die transienten Transfektionsexperimente mit Deletionskonstrukten der Promotorvariante F wiesen auf einen negativ- regulatorischen Bereich zwischen -490 bp und -440 bp hin. Die durch zielgerichtete Mutagenese erzeugten Mutationen innerhalb der putativen NF- kappaB- und CDP-Bindungsstellen führten zu einer signifikanten Erhöhung der Luciferase-Aktivität. Mittels des electrophoretic mobility shift assays (EMSA )/Supershift-Assays und des Shift-Western konnte die Bindung des Transkriptionsfaktors NF-kappaB p50 an die identifizierte Sequenz innerhalb des F-Promotors des hERalpha-Gens nachgewiesen werden. Die DNA-Bindung der Transkriptionsfaktoren p65, CDP und PHB konnte hingegen nicht eindeutig nachgewiesen werden. Die Inhibition der NF-kappaB-Aktivität durch Parthenolid der zuvor mit dem hERalpha-F-Promotorkonstrukt transient transfizierten AC16-Zellen führte zu einer signifikanten Erhöhung der transkriptionellen Aktivität des F-Promotors. Weitere Experimente ergaben, dass Parthenolid die Translokation von NF-kappaB p50 aus dem Zytoplasma in den Nukleus verhindert und folglich die Konzentration an NF-kappaB p50 im Nukleus signifikant reduziert. Die immunhistochemischen Befunde weisen auf ein erhöhtes Vorkommen an hERalpha im Nukleus und im Zytoplasma im Falle einer Inhibition der NF- kappaB-Aktivität hin. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der NF-kappaB- Signalweg ein Bestandteil des regulatorischen Mechanismus für die Expression von ERalpha in humanen Kardiomyozyten ist. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass 17beta-Östradiol (E2) die transkriptionelle Aktivierung der hERalpha-Promotoren A, B, C und F in Abhängigkeit von hERalpha bewirkt. So können letztlich inflammatorische Stimuli durch die Aktivierung und die anschließende Bindung von NF-kappaB an den hERalpha-F-Promotor einen suppressorischen Einfluss auf die hERalpha-Expression besitzen und E2/hERalpha einen antagonistischen Effekt auf die ERalpha-Promotoren im humanen Myokard ausüben.

Estrogens mediate their effects mainly through activation of the estrogen receptors ERalpha and ERbeta. The transcription of the human ERalpha gene can be initiated from seven different promoters (A, B, C, D, E, F and T) whose transcripts all differ in their 5’-UTR. These promoters are expressed in a cell- and tissue-specific manner. To investigate the transcriptional regulation of the hERalpha gene in the human myocardium, the alternative 5’-UTR variants of the hERalpha gene were initially identified using 5’-RACE, PCR and semiquantitative PCR. It could be shown that the ERalpha-mRNA is transcribed from multiple promoters, namely A, B, C and F, of which the F-promoter is the most frequently used variant. For functional in vitro studies in the human cardiac myocyte cell line AC16, portions of the different promoter sequences of the four identified promoters were amplified and cloned into the pGL2-basic luciferase reporter plasmid. The transient transfection experiments with deletion constructs of the promoter variant F exhibited a negative regulatory region between -490 bp and -440 bp. The induced mutations via site-directed mutagenesis within the putative NF-kappaB and CDP binding sites led to a significant increase of the luciferase activity. Using electrophoretic mobility shift assays (EMSA)/supershift assays and Shift- Western, the binding of the transcription factor NF-kappaB p50 to the identified sequence within the F-promoter of the hERalpha gene could be verified. However, the DNA-binding of the transcription factors p65, CDP and PHB could not be clearly identified. The inhibition of the NF-kappaB activity by parthenolide with the prior transiently transfected hERalpha-F-promoter construct into the AC16 cells led to a significant increase of the transcriptional activity of the F-promoter. Further experiments showed that parthenolide inhibits the translocation of NF-kappaB p50 out of the cytoplasm into the nucleus, and consequently significantly decreased the concentration of NF-kappaB p50 in the nucleus. The immunohistochemical findings point to an increased occurrence of hERalpha in the nucleus and in the cytoplasm in the case of inhibition of the NF-kappaB activity. These results suggest that the NF-kappaB signalling pathway is an integral part of the regulatory mechanism for the expression of ERalpha in human cardiomyocytes. In addition it could be shown that 17beta-estradiol (E2) induced the transcriptional activity of the hERalpha promoters A, B, C and F in a hERalpha dependent manner. Finally, inflammatory stimuli may suppress hERalpha expression via activation and subsequent binding of NF-kappaB to the hERalpha F-promoter, and E2/hERalpha may exert an antagonistic effect on the ERalpha promoters in the human myocardium.