T cell-based immunotherapy is a promising approach in treating haematological and solid malignancies. The specificity of a T cell is determined by its T cell receptor (TCR). The TCR recognizes epitopes within peptides that are bound to major histocompatibility complex (MHC) molecules. Current T cell-based therapies focus on CD8+ T cells, disregarding the CD4+ T cell population. The inclusion of CD4+ T cells could lead to a more complete T cell response. Current manufacturing protocols utilise ex vivo transduction, a protracted and costly process unsuited for generating mixed T cell products. The aim of this thesis was to show subset-specific gene transfer targeting T cell subsets in vitro and in vivo with a gammaretroviral (gRV) vector system pseudotyped with a Measles virus (MV) envelope. This approach simplifies the manufacturing process of mixed therapeutic T cell products while bypassing ex vivo culture. In the scope of this thesis, TCRs targeting a model antigen, Influenza A/PR/8/34 H1N1 hemagglutinin (HA), were selected, sequenced, optimised, and integrated into MV pseudotyped gRV specific for either CD4 (MVm4) or CD8 (MVm8). The TCRs used were two MHC class I H 2Kd-restricted TCRs called Clone 1 and Clone 4 as well as the MHC class II H2 IEd restricted SFE TCR. Two cancer cell lines capable of tumorigenesis in immunocompetent BALB/c mice were chosen for in vitro and in vivo evaluation, and derivate cell lines expressing the target antigen were generated. The MV pseudotyped gRV vectors MVm4 and MVm8 were used to transduce unsorted splenocytes in vitro, delivering a transgene encoding for the model TCRs to their corresponding subsets. CD8+ T cells transduced with either Clone 1 or Clone 4 TCR exhibited secretion of IFNγ relative to the dose of antigenic stimulus upon co-culture with peptide loaded splenocytes and antigen-expressing cancer cell lines. Correspondingly, CD4+ T cells transduced with the SFE TCR showed antigen dependent secretion of IL-2 in co culture experiments with dendritic cells loaded with peptide or cancer cell lysate. MVm4 and MVm8 were tested in an in vivo model - they were applied systemically to BALB/c mice to redirect their T cell response against the antigenic stimulus of HA-expressing cancer cells. Homing, expansion, and contraction of T cells was monitored via live imaging for a timeframe of 73 days by luciferases co-expressed with the TCR. In conclusion, the MV pseudotyped gRV system was successfully adopted to BALB/c mice, confirming targeted in vivo transduction of CD8+ T cells and providing the first evidence of targeted in vivo transduction of CD4+ T cells leading to a functional MHC class II restricted T cell response.
T-Zell-basierte Immuntherapie ist ein vielversprechender Fortschritt in der Behandlung von hämatologischen und soliden malignen Erkrankungen. Der T-Zell-Rezeptor (TCR) bestimmt die Spezifität von T-Zellen. Mittels TCR erkennen T-Zellen Epitope innerhalb von Peptiden, die durch Haupthistokompatibilitätskomplex-Moleküle (MHC) präsentiert werden. Derzeitige Immuntherapien fokussieren sich auf CD8+ T-Zellen und vernachlässigen die Rolle von CD4+ T Zellen. Der Einschluss von CD4+ T-Zellen würde eine umfassendere T-Zell-Antwort induzieren. Aktuelle Herstellungsprotokolle verwenden langwierige und kostspielige ex vivo Transduktion, ein Prozess, der nicht für die Herstellung gemischter T-Zell-Produkte geeignet ist. Das Ziel dieser Dissertation war der T-Zell Subgruppen-spezifische in vitro und in vivo Gentransfer mittels Masernvirus (MV) Hüllprotein-pseudotypisierter gammaretroviraler Vektoren (gRV). Diese Methode vereinfacht den Herstellungsprozess T-Zell-basierter Immuntherapien und umgeht die ex vivo T-Zell-Kultur. Im Rahmen dieser Dissertation wurden TCRs ausgewählt, die ein Modellantigen, Influenza A/PR/8/1934 H1N1 Hämagglutinin (HA), erkennen. Diese wurden sequenziert, optimiert und in MV Hüllprotein pseudotypisierte gRV, spezifisch entweder für CD4 (MVm4) oder CD8 (MVm8), integriert. Die verwendeten TCRs waren die zwei MHC Klasse I H 2Kd restringierten TCR Clone 1 und Clone 4, sowie der MHC Klasse II H2-IEd restringierte SFE TCR. Es wurden zwei Krebszelllinien für in vitro und in vivo Versuche ausgewählt, die eine Tumorerkrankung in immunkompetenten BALB/c Mäusen etablieren und Antigen exprimierende Derivate dieser Zelllinien generiert. Mit den MV Hüllprotein-pseudotypisierten gRV MVm4 und MVm8 wurden unsortierte Splenozyten in vitro transduziert und ein Transgen, kodierend für den passenden TCR für die jeweilige Subgruppe, übertragen. Transduzierte CD8+ T-Zellen, die entweder Clone 1 oder Clone 4 TCR exprimierten, zeigten eine dosisabhängige IFNγ-Sekretion in Ko Kultur Experimenten nach Antigenstimulus, sowohl durch Peptid-beladene Splenozyten als auch durch Antigen-exprimierende Zelllinien. Demgemäß sekretierten SFE TCR transduzierte CD4+ T-Zellen dosisabhängig IL-2 in Ko-Kultur-Experimenten mit Peptid- oder Krebszelllysat-beladenen dendritischen Zellen. MVm4 and MVm8 wurden in einem in vivo Modell erprobt, indem sie systemisch BALB/c Mäusen appliziert wurden, um deren T Zellantwort gegen HA-exprimierende Krebszelllinien zu richten. Homing, Expansion und Kontraktion der T-Zellen wurde über einen Zeitraum von 73 Tagen im Live-Imaging mittels, neben dem TCR koexprimierter, Luziferase dargestellt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das MV Hüllprotein pseudotypisierte gRV-System die spezifische in vivo Transduktion von CD8+ T-Zellen in BALB/c Mäusen zeigen konnte, weiterführend wurden erstmalig die zielgerichtete in vivo-Transduktion von CD4+ T-Zellen und die resultierende MHC Klasse II restringierte T-Zellantwort gezeigt.
