Multiple gene editing of T Cell inhibitory receptors via CRISPR/Cas9 in EL4 cells

Abstract

In cancer, inhibitory signals or specific antigens present on tumor cells induce a state of T cell exhaustion. Targeting these immune inhibitory mechanisms and reactivating the anticancer immune reaction has been the idea of immune checkpoint blockade (ICB). Despite the initial success and remarkable long-term responses emerging from monoclonal antibody-based ICB, checkpoint inhibition entails immune-related adverse events (irAEs). In order to avoid immunotherapy-associated toxicity while improving therapeutic efficacy, we investigated the feasibility of the genetic editing of tumor inhibitory receptors (TIRs) to be major players in the inhibition of T cell activity. We successfully generated triple edited EL4 cells via CRISPR/Cas9-mediated disruption of PD-1, LAG-3 and TIM-3. Transfected EL4 cells showed reduction in immune checkpoint molecule expression, especially for PD-1 signals. Furthermore, we selected triple edited clones with a reduction of protein expression of all three targeted molecules and performed Sanger sequencing on their DNA. The sequencing analysis showed a mixture of different sequence profiles. This genetic chimerism often occurs when mutating a gene of interest using the CRISPR/Cas9 method. Taken together, we were able to create EL4 lymphoma cell clones with genetic disruption of all three TIRs: PD-1, LAG-3 and TIM-3. We have developed a temporary concept of CRISPR/Cas9-mediated triple gene editing of TIRs on EL4 lymphoma cells which needs to be transferred to T cells and further explored for a convertible option for T cell therapy in a clinical setting.

Bei Tumorerkrankungen führen inhibierende Signale oder spezifische Antigene, die auf den Tumorzellen präsentiert werden, zu einem Erschöpfungszustand der T Zellen. Das Grundprinzip der Immuncheckpoint Blockade (ICB) ist es, in diese immuninhibierenden Mechanismen einzugreifen und die körpereigene Immunreaktion auf Tumorzellen wiederherzustellen. Obwohl die Immuncheckpoint Blockade, basierend auf monoklonalen Antikörpern, zunächst großen Erfolg und ein bemerkenswertes, langfristiges Therapieansprechen zeigte, resultieren daraus andererseits auch immunvermittelte Nebenwirkungen, sogenannte „immune related adverse events“ (irAEs). Mit dem Ziel einer geringeren Immuntherapie assoziierten Toxizität bei gleichzeitig verbesserter therapeutischer Effizienz, prüften wir die Durchführbarkeit einer genetischen Editierung von Tumor inhibierenden Rezeptoren (TIRs), welche eine große Rolle in der Inaktivierung der T Zell Aktivität spielen. Wir generierten dreifach editierte EL4 Zellen, indem wir mittels CRISPR/Cas9 eine Gendisruption für PD-1, LAG-3 und TIM-3 erzielten. Transfizierte EL4 Zellen zeigten eine Reduktion in der Expression der Immuncheckpoint Moleküle. Dies zeigte sich besonders bei PD-1 Signalen. Des Weiteren selektierten wir dreifach editierte Zellklone, die eine verminderte Proteinexpression aller drei Zielmoleküle aufwiesen, und führten eine DNA Sequenzierung nach Sanger durch. Die Sequenzanalyse zeigte eine Mischung verschiedener Sequenz Muster. Dieser genetische Chimärismus tritt häufig bei CRISPR/Cas9 vermittelten Genmutationen auf. Zusammenfassend ist es uns gelungen, EL4 Zellklone mit einer Störung der Gene der Tumor inhibierenden Rezeptoren PD-1, LAG-3 und TIM-3 zu generieren. Wir entwickelten ein vorübergehendes Konzept einer CRISPR/Cas9 vermittelten, dreifachen genetischen Editierung von Tumor inhibierenden Rezeptoren auf EL4 Zellen. Dieses Konzept kann nun auf T Zellen übertragen und weiterentwickelt werden, um als mögliche Anwendung für T Zell Therapie in einem klinischen Setting genutzt zu werden.