Identifikation der p53-Zielgene phlda3 und sestrin2 als Teil eines mTOR- vermittelten Seneszenz-Signalwegs

Abstract

Einleitung: Zelluläre Seneszenz ist ein permanenter Arrest in der G1-Phase des Zellzyklus und tritt auf in alternden Zellen sowie als Reaktion auf akute zelluläre Belastungen, wie z.B. DNA-schädigende Chemotherapie. Therapie- induzierte Seneszenz (TIS) wird durch den Tumorsuppressor p53 vermittelt. Die Aktivierung von p53 induziert die Expression einer Reihe von Zielgenen, einschließlich sestrin2 und phlda3, die die mTOR-Aktivität modulieren: Sestrin2 über die Aktivierung von AMPKα und phlda3 über eine Hemmung von AKT. Anhand des Eμ-myc-Maus-Lymphom-Modells wird gezeigt, dass die sestrin2- und phlda3-vermittelte Hemmung der mTOR-Funktion eine wichtige Komponente des p53-induzierten Seneszenz-Programms darstellt. Methoden: p53-profiziente (Kontrolle) und p53-defiziente Lymphomzellen (LC) und LCs mit regulierbarem p53 (p53ERTam, ein 4-OH-Tamoxifen (TAM)-induzierbares p53) wurden mit bcl2 transduziert, um Apoptose zu blockieren. Anschließend wurden sie mit dem DNA- schädigenden Zytostatikum Adriamycin (ADR) bzw. TAM behandelt, um Seneszenz in vitro zu induzieren. Seneszenz wurde basierend auf der Seneszenz- assoziierten-β-Galactosidaseaktivität (SA-β-Gal) und BrdU/PI-Zellzyklus- Analysen nachgewiesen. Der AKT-und mTOR-Signalweg wurden durch Western Blot untersucht. Die Induktion von 39 bona fide p53-Zielgenen und 57 Seneszenz- assoziierten Genen wurde durch RTq-PCR analysiert. Pharmakologischen Wirkstoffe wie der AMPKα-Aktivator Metformin, der AKT-Inhibitor Triciribine, der mTOR-Inhibitor Rapamycin und der stabile Knockdown des Tuberosklerose-Gens (TSC2) wurden verwendet, um die Rolle des mTOR-Signalwegs in Seneszenz zu untersuchen. Außerdem wurde die Antitumoraktivität von Rapamycin in vivo getestet. Ergebnisse: p53ERTam-LCs mit aktiviertem p53 und ADR-exponierte Kontroll-LCs zeigten im Gegensatz zu ADR-behandelten p53-defizienten LCs eine Zunahme der SA-β-Gal-Aktivität und einen G1-Zellzyklusarrest. Im Vergleich der ADR- vs. TAM-seneszenten LCs konnten 12 gemeinsame p53-induzierbare Zielgene, einschließlich sestrin2 und phlda3 identifiziert werden. Die Aktivierung von p53 führte also über die Suppression von AKT und die Induktion von AMPKα zur Inaktivierung des mTOR-Signalwegs. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass nur die Kombination einer pharmakologischen Aktivierung von AMPKα und Hemmung von AKT zu einem seneszenten Phänotyp in LCs führte. Dementsprechend hat ein Knockdown von TSC2 TIS zumindest teilweise blockiert. Schließlich führte die Behandlung mit dem mTOR-Inhibitor Rapamycin zur Induktion von Seneszenz in p53-kompetenten und –defizienten Lymphomen. Dies suggeriert, dass die oben beschriebenen Signalwege tatsächlich Seneszenz downstream von p53 herbeiführen. Die in vivo Behandlung mit Rapamycin führte sowohl in Kontroll- Lymphomen, als auch in p53-defizienten Lymphomen zu einer verlängerten Überlebenszeit mit Induktion von Seneszenz in den Lymphknoten, nicht aber in mock-behandelten Kontrollen. Fazit: Seneszenz wird charakterisiert durch die Aktivierung eines Netzwerkes von p53-abhängigen Zielgenen. Zwei Schlüsselkomponenten dieses Netzwerks - sestrin2 und phlda3 – modulieren die mTOR-Aktivität über TSC2 und agieren damit als wesentliche Mediatoren des Seneszenz-Programms.

Introduction: Cellular senescence is a permanent cell cycle arrest occurring as a G1 growth arrest in ageing cells or in response to acute cellular stresses, such as DNA-damaging chemotherapy. Therapy-induced senescence (TIS) depends on the activity of the tumor suppressor p53. Activation of p53 induces a set of target genes, including sestrin2 and phlda3, which modulate mTOR activity: Sestrin2 via activation of AMPKα, and phlda3 via inhibition of AKT. By using the Eμ-myc mouse lymphoma model, we show here that sestrin2- and phlda3-mediated inhibition of mTOR represent important components of the p53-governed senescence program. Methods: p53 proficient (control) and p53 deficient lymphoma cells (LC) and those with regulatable p53 activity (p53ERTam, a 4-OH-tamoxifen (TAM)-inducible p53 moiety) were transduced with bcl2 to block apoptosis. Subsequently, they were treated with the DNA-damaging agent Adriamycin (ADR) or TAM to induce senescence in vitro. Senescence was detected based on senescence-associated-β-galactosidase activity (SA-β-Gal) and BrdU/PI cell cycle analyses. AKT and mTOR pathways were assessed by Western Blotting. The induction of 39 bona fide p53 target genes and 57 senescence associated genes was analyzed by RQ-PCR. Pharmacological agents, e.g. metformin – an activator of AMPKα, the AKT-inhibitor triciribine, the mTOR-inhibitor rapamycin, and stable knockdown of the Tuberosis Sclerosis 2 (TSC2) gene product by sh-RNA were used to dissect the role of the mTOR pathway in senescence. Results: p53 restored p53ERTam-LC and ADR-exposed control LC, unlike equally ADR treated p53 deficient LC, showed increased SA-β-Gal activity and a G1 cell-cycle arrest. An overlapping set comprising of 12 p53 inducible target genes, including sestrin2 and phlda3, was identified among ADR- vs. Tam-senescent LC. Concordantly, p53 activation repressed the AKT pathway and induced AMPKα, both contributing to the inactivation of mTOR. We furthermore showed that only combined pharmacological activation of AMPKα and inhibition of AKT induced a senescent phenotype in LC. Accordingly, knockdown of TSC2, at least in part, blocks TIS. Finally, treatment with the mTOR inhibitor rapamycin induced senescence in both p53-proficient and -deficient settings, thereby suggesting that the above described pathways indeed orchestrate senescence downstream of p53. Treatment of control lymphoma and p53 deficient lymphoma in vivo with rapamycin lead to a prolonged survival with senescence detectable in lymph nodes of Rapamycin treated mice, but not their control counterparts. Conclusion: Senescence is characterized by the activation of a p53 dependent target gene network. Two key components of this network – sestrin2 and phlda3 – modulate mTOR activity via TSC2 and thereby operate as essential mediators into senescence.