Anreicherung und biochemische Charakterisierung einer Proteinacyltransferase (PAT) aus mikrosomalen Membranen

Abstract

Hintergrund Die S-Acylierung, eine hydrophobe, posttranslationale Proteinmodifikation, wurde in dieser Arbeit anhand verschiedener in-vitro- Experimente untersucht. Das Interesse lag dabei auf dem Mechanismus der Fettsäureübertragung bzw. der Enzymologie der Modi­fikation. Diese ist bisher noch weitestgehend ungeklärt. So war die Etablierung eines leistungs­fähigeren in-vitro-Systems zum Testen S-acylierender Aktivität mit dem Fernziel der Reinigung der PAT zentrales Anliegen der vorliegenden Arbeit. Die Etablierung neuer Enzymnachweise mit Peptiden und rekombi­nanten Proteinen als Akzeptoren diente zum einen dazu, neue ?tools? und Methoden für die Anreicherung zur Verfügung zu stellen, zum anderen konnte mit ihrer Hilfe die Palmitoylierung weiter charakterisiert werden. Der bioche­mischen und zellbiologischen Charakteri­sierung dienten auch die Lokalisationsversuche.

Ergebnisse (1.) An Zellulosemembranen gebundene Peptide, die der Acylierungsregion palmitoy­lierter Proteine entsprechen, ließen sich im in- vitro-PAT-Assay nicht als Akzep­toren verwen­den. Die Ergebnisse mit diesen Peptiden decken sich mit den in der Literatur beschriebenen in-vitro- Untersuchungen (Ba?ó et al., 1998). In diesen Untersuchungen fehlt jedoch der Vergleich mit den Original­proteinen, so daß ihre Aussagekraft aufgrund unserer Ergebnisse neu hinterfragt werden sollte. (2.) Es konnte weder mit dem in E.coli exprimierten Fusionsprotein GAP-43-GFP-His6 mit 10 AS des Aminoterminus noch mit dem ebenfalls in E.coli exprimierten Protein SNAP-25-His6 als Akzeptor ein in-vitro-PAT-Nachweis etabliert werden. Als Grund hierfür können die Fremdexpression in E.coli oder die Verkürzung der Akzeptorproteine sein, die eventuell den Verlust von Erkennungssignalen für die Palmitoylierung bewirken. (3.) Die Anreicherung von PAT aus Mikrosomen humaner Plazenta wurde mit chromatographischen Methoden angestrebt. PAT Aktivität konnte mit nichtionischem Detergens TX-100 solubilisiert werden und mittels zwei säulenchromatographischer Anrei­che­rungsschritte (DEAE-Sepharose und blue-Sepharose) angereichert werden. Diese Aktivität erwies sich aber als äußerst labil und ließ sich nicht weiter aufreinigen (4.) Untersucht wurde die subzelluläre Verteilung der PAT-Aktivität, welche p59fyn palmitoyliert. Die Fraktionen Plasmamembran, Golgi-Apparat und endoplas­ma­tisches Reti­ku­lum aus Rattenlebergewebe wurden auf PAT-Aktivität untersucht. Es zeigte sich, daß die Aktivität für die eingesetzten Akzeptorproteine nur in Golgi- und Plasmamem­branen, nicht aber in endoplasmatischem Retikulum zu finden war. Weitere Experimente zeig­ten, daß sich die Solubilisierungs-Eigenschaften der membran­gebundenen Aktivi­täten in Plasmamembran und Golgi unterscheiden.

Interpretation Obwohl das Ziel einer Enzymreinigung nicht erreicht wurde, können die Ergebnisse dieser Arbeit einen Beitrag zur aktuellen Diskussion der Palmitoylierung liefern. Sie zeigen, daß die Wahl des Enzymnachweises von kritischer Bedeutung ist Die gewonnenen Daten stützen die Theorie eines enzyma­tischen Mechanismus der Fettsäureübertragung, da sie eine membranassoziierte S-Acylierungs-Aktivität zeigen, welche an Proteine gebunden zu sein scheint. Die subzelluläre Verteilung der Aktivität mit unterschiedlichen Solubilisierungs­eigen­schaften läßt vermuten, daß es sich dabei um unterschiedliche Enzyme einer Enzym-Familie handelt.

Background This work describes the investigation of protein S-acylation as a hydrophobic posttranslational modification by different in vitro experiments. The main interest was on the mechanism of fatty acid transfer onto the protein with a special emphasis on the enzymology of the modification, which still remains mostly unknown. In order to find evidence for an enzymatic process it will be necessary to isolate and identify an enzyme at the molecular level. In this regard purifying an enzyme with protein fatty acyl transferase (PAT) activity was the aim of this work. Establishing an enzyme assay using peptides and recombinant proteins as substrates for PAT, the central focus of the investigations, served both to develop new tools for purifying PAT and to further characterize S-acylation. Biochemical and cell biological characterizations were also gained from the experiments which aimed for localizing the enzyme within the cell and cell membranes.

Results (1.) Immobilized peptides which mimic sequences of palmitoylated proteins did not function as substrates (fatty acid acceptors) in the tested in vitro PAT-assays. Palmitoyl-CoA was transferred onto these synthetic peptides but the results did not match the results given in experiments with the corresponding protein. The results agree with in vitro PAT assays described in literature (Ba?ó et al., 1998). But for this investigation there is no comparison to the original protein which questions their meaningfulness in site of our results. (2.) No in vitro PAT-assay was established using SNAP-25-His6 or GAP43-GFP-His6 recombinant proteins expressed in E.coli as substrates. So we hypothesize that the expression of the 10 amino acid fusion protein in E. coli is not sufficient to confer palmitoylation. (3.) In the purification process of the PAT-enzyme from human placenta microsomes, we were able to advance the purification by adding further chromatographic steps (DEAE fast flow and blue-Sepharose). After these steps the activity was very labile which prevented further purification. (4.) The investigation of the subcellular distribution of PAT-activity which palmitoylates p59fyn gave interesting results. Only Golgi and plasma membrane showed PAT activity towards the Fyn substrate and not the endoplasmic reticulum. Further comparison revealed differences in the solubility of the activity from plasma membrane and Golgi.

Interpretation Even though the goal of purifying the PAT enzyme to a single band as analyzed by electrophoresis was not reached, the reported results of this research contributes new scientific information on the ongoing investigations of palmitoylation. They show that the choice of enzymatic assays plays a critical role and that the comparison of the synthetic substrate to the original or native protein is an important control to critically assess biochemical palmitoylation data. In the data provided by our results the membrane bound PAT-activity shows characteristics of a protein related, enzymatic activity. Therefore it supports the theory of an enzymatic mechanism of palmitoylation. The various subcellular distributions of PAT activity and the difference in the solubilization properties of these PAT activities suggest the existence of different members of a PAT family.