Since the sequencing of the first human genome in 2001, Whole-Genome-Sequencing (WGS) has made great progress. It is now possible to apply the method in everyday clinical diagnostics. However, there are established approaches for the identification of mutations, which, due to years of application, have a high status in genetic diagnostics. To what extent WGS represents a complement or even an alternative to these methods, and which diagnostic results are possible by considering the genome in its completeness, will be investigated in the present work. Sixty-nine cases with malformations of at least one limb received WGS, excluding those who had already received a molecularly confirmed genetic diagnosis. The data of all were processed using VarFish (version v0.17.2) and SODAR (System for Omics Data Analysis and Retrieval) and then analyzed manually. Single nucleotide variants (SNVs) and structural variants (SVs) in the protein-coding and non-protein-coding re-gions of the genome were examined. Subsequently, GLI3 and HMGB1 were investigated for possible genotype-phenotype correlations using findings from the WGS. Overall, we identified pathogenic variants in twelve cases (17.4%). SNVs appeared in four patients in each of the genes FGFR1, FGFR2, GLI3, and BHLHA9. The variant in FGFR1 had already been described in the literature, the other three were detected for the first time. In one case, a variant in HMGB1 was identified as pathogenic. Further-more, SNVs were detected in two potentially disease-causing genes (SEMA3D, ALDH1A). In addition, UBA2 variants were found in two ectrodactyly cases in the cohort, as well as another case known to the Institute of Medical Genetics and Human Genetics. This supports the current hypothesis of UBA2 as a disease gene. In addition to SNVs, two complex SVs were detected. One inversion, which is flanked by a deletion, was found in a patient with ectrodactyly at the locus of split hand foot malformation (SHFM) 3. The other variant is a complex translocation between 7q36.3 and 9p24.1 in a patient with bilateral mirror-image polydactyly of the hands and feet. Furthermore, a pathogenic alanine repeat expansion in HOXD13 was identified in a patient with synpolydactyly. No pathogenic variants could be found in the non-protein-coding region of the genome. In GLI3 and HMGB1, new findings regarding the geno-type-phenotype correlations at the corresponding loci were obtained. Thus, of sixty-nine cases in which conventional methods did not previously yield a genetic diagnosis, WGS enabled the establishment of a diagnosis in twelve cases (17.4%). In addition, WGS provided the basis for a closer look at the loci of GLI3 and HMGB1, with final-exon frameshifts of HMGB1 being identified as the cause of brachyphalangia-polydactyly-tibia-hypo/aplasia syndrome. Future improvements in sequencing methods, as well as in processing and evaluation software, are expected to further increase the diagnostic yield of WGS. However, it is already proving to be a potent tool for everyday clinical genetics, as well as various research approaches. As a single comprehensive test, it allows the identification of multiple variants of several types, including small but complex structural variants that are not detected by conventional methods.
Seit der Sequenzierung des ersten menschlichen Genoms 2001 hat die Ganz-Genom-Analyse (Whole-Genome-Sequencing, WGS) große Fortschritte gemacht. Mittlerweile ist es möglich, die Methode im klinisch-diagnostischen Alltag anzuwenden. Allerdings existieren etablierte Verfahren zur Identifikation von Mutationen, welche durch jahrelange Anwendung einen hohen Stellenwert in der genetischen Diagnostik einnehmen. Inwiefern WGS eine Ergänzung oder gar Alternative zu diesen Verfahren darstellt, und welches diagnostische Potential die Methode besitzt, soll in der vorliegenden Arbeit untersucht werden. In 69 Fällen mit angeborenen Fehlbildungen von mindestens einer Extremität, bei denen die genetische Routinediagnostik keine pathogene Variante identifizieren konnte, wurde ein WGS durchgeführt. Die Daten aller Patient*innen wurden mit Hilfe von VarFish (Version v0.17.2) und SODAR (System for Omics Data Analysis and Retrieval) prozessiert und danach manuell ausgewertet. Dabei erfolgte die Betrachtung von Einzelnukleotidvarianten (Single Nucleotide Variants, SNVs) und Strukturvarianten (SVs) im proteinkodierenden wie nicht-proteinkodierenden Bereich des Genoms. Im Anschluss wurden GLI3 und HMGB1, hinsichtlich möglicher Genotyp-Phänotyp-Korrelationen untersucht, wobei Erkenntnisse aus dem WGS als Grundlage genutzt wurden. Insgesamt konnten pathogene Varianten in 12 Fällen (17.4%) identifiziert werden. SNVs zeigten sich in vier Patienten jeweils in den Genen FGFR1, FGFR2, GLI3 und BHLHA9. Die Variante in FGFR1 war bereits in der Literatur beschrieben worden, die anderen drei wurden erstmals nachgewiesen. In einem weiteren Fall konnte eine Variante in HMGB1 als pathogen identifiziert werden. Weiterhin konnten SNVs in zwei potenziell krankheits-auslösenden Genen (SEMA3D, ALDH1A) aufgefunden werden. Darüber hinaus fanden sich UBA2-Varianten in zwei Ektrodaktylie-Fällen der Kohorte sowie einem weiteren, dem Institut für Medizinische Genetik und Humangenetik bekannten, Fall. Dies unterstützt die aktuelle These von UBA2 als Krankheitsgen. Neben den SNVs konnten zwei komplexe SVs gefunden werden. Weiterhin konnte eine pathogene Alanin-Repeat-Expansion in HOXD13 identifiziert werden. Es konnten keine pathogenen Varianten im nicht-protein-kodierenden Bereich des Genoms gefunden werden. Bei GLI3 und HMGB1 wurden neue Erkenntnisse bezüglich der Genotyp-Phänotyp-Korrelationen an den entsprechenden Loci gewonnen. Insgesamt konnte bei 12 (17,4%) von 69 Fällen, bei denen herkömmliche Verfahren bisher keine molekular-genetische Diagnose erbrachten, durch das WGS die Etablierung einer Diagnose ermöglicht werden. Darüber hinaus, lieferte WGS die Grundlage für die genauere Betrachtung der Loci von GLI3 und HMGB1, wobei final-exon frameshifts von HMGB1 als Ursache des Brachyphalangie-Polydaktylie-Tibia-Hypo/Aplasie-Syndroms identifiziert werden konnten. Durch künftige Verbesserung von Sequenzierungsmethoden sowie prozessierender und auswertender Software ist zu erwarten, dass die diagnostische Rate des WGS weiter ansteigen wird. Allerdings zeigt es sich bereits heute als potentes Verfahren für den klinisch-genetischen Alltag sowie verschiedene Forschungsansätze. Es ermöglicht als ein einziger umfassender Test die Identifikation von Varianten unterschiedlichen Typs, inklusiver kleiner, aber komplexer Strukturvarianten, die durch herkömmliche Verfahren nicht erfasst werden.
