Charakterisierung humaner Hautmodelle - Stabilität und metabolische Kapazität sowie vergleichende Untersuchungen zur perkutanen Absorption

Abstract

In den letzten Jahren wurde zunehmend die Forderung nach tierversuchsfreien Methoden bei der Sicherheitstestung von Kosmetika, der Risikobewertung von Chemikalien und der Arzneimittelprüfung in Richtlinien der EU aufgenommen. Die alternativen Testmethoden zur Bestimmung der perkutanen Absorption sollen dabei die Reaktion der humanen Haut in vivo besser vorhersagen als es mit tierischer Haut möglich ist. Obwohl frisch exzidierte Humanhaut als bevorzugte Testmatrix betrachtet werden kann, ist ihr Routineeinsatz oft wegen unzureichender Verfügbarkeit schwierig. Daher gewinnen die seit einiger Zeit kommerziell verfügbaren biotechnologisch gewonnenen menschlichen Hautmodelle zunehmend an Bedeutung für die toxikologische Prüfung. Die OECD akzeptiert ihren Einsatz bei der Untersuchung der perkutanen Absorption, sobald der Nachweis erbracht ist, dass die Resorption von Referenzchemikalien an Hautmodellen mit deren Resorption an humaner oder porciner Haut vergleichbar ist. Dazu bedarf es jedoch einer gründlichen Standardisierung und Validierung der Testmethode. Dazu wurden die Hautmodelle zunächst hinsichtlich ihrer Stabilität unter den Bedingungen der Permeationsuntersuchungen näher charakterisiert. So zeigten Viabilitäts- und Integritätsuntersuchungen eine deutliche Toxizität bei rekonstruierter Epidermis und bei primären Keratinozyten in Kultur, die mit unterschiedlichen Defizienzmedien für 6 h behandelt wurden. In beiden Fällen reduzierte der Zusatz von 5 % BSA, welches von der OECD als Rezeptormedienzusatz zur Verbesserung der Löslichkeit von hochlipophilen Substanzen in Versuchen zur perkutanen Absorption empfohlen wird, die Viabilität nochmals. Es wurde gezeigt, dass apoptotische Vorgänge zwar zum Teil an der Abnahme der Keratinozytenviabilität beteiligt sind, bei der durch BSA verursachten Toxizität allerdings keine Rolle spielen - bei dem finalen, BSA-bedingten Zelluntergang handelt es sich also um Nekrose. Diese Beobachtungen müssen bei der Auswahl der Rezeptormedien bei perkutanen Absorptionsstudien berücksichtigt werden, bei denen die Bestimmung des Metabolismus der untersuchten Substanz und damit die Viabilität der Matrix von Bedeutung sind. Die kutane Biotransformation von Coffein, deren Bedeutung sich aus der topischen Anwendung des Xanthins als Kosmetikabestandteil, vor allem aber seiner exponierten Stellung als OECD-Referenzsubstanz ergibt, wurde im Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal an humanem Hautmaterial - nämlich primären Keratinozyten, Fibroblasten sowie einem Epidermis- und einem Vollhautmodell - untersucht. Für Coffein und das parallel untersuchte Xanthin Theophyllin konnte eine - aufgrund der Überschneidung der Stoffwechselwege - gemeinsame HPLC-Analytik etabliert werden. Für beide Xanthine zeigte sich stets nur eine geringe Metabolisierung (< 1 %). Hinsichtlich der im Folgenden durchgeführten Permeationsuntersuchungen mit Coffein bedeutete dies, dass eine biotransformationsbedingte Beeinflussung des Penetrations- / Permeationsverhaltens der Substanz damit sicher ausgeschlossen werden konnte. Sowohl qualitativ als auch quantitativ war die Biotransformation beider Xanthine an den Monolayerkulturen mit der an den Hautmodellen ähnlich - es konnte also gezeigt werden, dass die metabolische Kapazität beider Testsysteme vergleichbar ist. Schließlich wurden anhand der OECD-Referenzsubstanz Coffein und der Franzzelltechnik unter Berücksichtigung der vorangegangenen Beobachtungen erste wichtige Schritte zur Standardisierung und Validierung der Testmethode zur Bestimmung der perkutanen Absorption vorgenommen. Mehrere, die Permeation möglicherweise beeinflussende Aspekte wurden experimentell untersucht. Das so entwickelte einheitliche und verbesserte Versuchsprotokoll wurde nun in vergleichenden Permeationsuntersuchungen an unterschiedlichen Matrices angewendet. Die relevanten Permeationsparameter konnten eindeutig definiert werden.

In recent years, the demand for alternative test methods in safety assessment of cosmetics, risk assessment of chemicals, and testing of pharmaceuticals was increasingly included in the EU directives. Thereby, alternative test methods for the determination of percutaneous absorption should achieve a more reliable in vivo prediction of the response of human skin than animal skin. Even though freshly excised human skin is considered as a preferred test matrix its routine use is often difficult due to insufficient supply. Thus, in recent years commercially available and biotechnologically manufactured human skin models have increasingly gained in importance for toxicological testing. The OECD accepts their application for the examination of percutaneous absorption, given absorption of reference chemicals by the skin models is comparable to that by human or porcine skin. To provide evidence a thorough standardisation and validation of the test method is required. For this purpose first of all the skin models were characterised more closely regarding their stability towards the conditions of a permeation experiment. Both viability and integrity tests revealed a clear toxicity of different deficiency media after 6 h incubation with reconstructed epidermis or primary cultured keratinocytes. In both matrices, the addition of 5 % BSA which is advocated by the OECD as additive to the receptor medium for percutaneous absorption studies to facilitate solubility of highly lipophilic substances let to an additional reduction of viability. It was shown that apoptosis is in fact partly involved in the reduction of keratinocyte viability provoked by deficiency media but is irrelevant for the BSA caused toxicity - the final, BSA-related cell death is a matter of necrosis. These results have to be considered when selecting appropriate receptor media for percutaneous absorption studies in which metabolism of a substance and accordingly matrix viability are of major importance. Cutaneous metabolism of caffeine is of importance because of its topical use as active ingredient in cosmetics and especially because of its exposed position as OECD reference substance. For this reason in the context of this work the metabolism of caffeine was investigated in human skin material - namely in primary keratinocytes, fibroblasts and an epidermal and full thickness skin model - for the first time. For caffeine and the xanthine theophylline which was tested in parallel a concerted HPLC-method was established because of their overlapping metabolic pathways. Both xanthines were metabolised only to a small extent (< 1 %). With respect to the following permeation experiments with caffeine an impact on penetration / permeation of the substance due to metabolism could clearly be ruled out a priori. Metabolism of the xanthines by the monolayer cultures was comparable to that by the skin cultures both qualitatively and quantitatively. Thus, we showed that metabolic capacity of both test systems is similar. Finally, first important steps towards standardisation and validation of the test method for determination of percutaneous absorption were undertaken in consideration of the previous results using the OECD reference substance caffeine and the Franz cell technique. Several aspects possibly influencing permeation were investigated experimentally. A consistent and improved experimental protocol could be developed and was then applied to comparative permeation tests with different skin matrices. Relevant permeation parameters could be clearly defined.