Zusammenfassung Zweikomponentensysteme sind wichtige Systeme von Bakterien, die eine Anpassung an wid-rige Umweltbedingungen gewährleisten. Üblicherweise erfolgt die Aktivierung eines Zwei-komponentensystems, indem eine Sensorkinase (SK) ein meist externes Signal wahrnimmt, sich an ihrem konservierten Histidinrest autophosphoryliert und im Anschluss daran das Phosphat auf einen Aspartatrest innerhalb des zugehörigen Responseregulators (RR) über-trägt. Der Responseregulator ändert in phosphorylierter Form seine Konformation und kann dann häufig als Transkriptionsfaktor die Expression von Zielgenen beeinflussen. Neben dieser „orthodoxen“ Aktivierung (Phosphotransfer von SK auf RR) sind in den letzten Jahren immer mehr so genannte „nicht-orthodoxe“ Wege der Aktivierung von Zweikomponentensystemen charakterisiert worden. Eine Möglichkeit dieser „nicht-orthodoxen“ Regulation innerhalb von Zweikomponentensys-temen ist der Crosstalk. Dabei sind einige Sensorkinasen unter bestimmten Bedingungen in der Lage neben ihren Partnerresponseregulatoren auch weitere Responseregulatoren zu phosphorylieren (Groban et al., 2009; Mika et al., 2005). Des Weiteren können erst kürzlich beschriebene so genannte Konnektoren vielfältig eine Wirkung auf die Aktivität von Zwei-komponentensystem-Proteinen ausüben. Konnektoren sind meist kleine Proteine, die durch einen spezifischen Signaltransduktionsweg induziert werden und in die Regulation durch ein anderes System, z.B. eines Zweikomponentensystems, eingreifen. Innerhalb dieser Arbeit wurden drei weitere dieser so genannten „nicht-orthodoxen“ Aktivie-rungsmechanismen innerhalb von Zweikomponentensystemen identifiziert und/oder näher charakterisiert. Erstens wurde die Fettsäure Lysophosphatidylglycerin (LPG) als ein neues Effektormolekül, das an der Regulation von Sensorkinasen und somit von Zweikomponentensystemen beteiligt ist, identifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass das aus der Spaltung von Phosphatidylglyce-rin durch die Phospholipase RssA generierte Lysophosphatidylglycerin in vitro in der Lage ist, die Sensorkinasen ArcB, BarA, BaeS und RstB in ihrer Autophosphorylierungsfähigkeit zu hemmen. Freie Fettsäuren, die ebenfalls bei der RssA-vermittelten Spaltung von Phospha-tidylglycerin entstehen, zeigten keinen Einfluss auf die Autophosphorylierung von ArcB. Vorläufige Hinweise, dass LPG tatsächlich auch in vivo relevant ist, lieferten Mikroarrayana-lysen, die eine durch RssA/LPG vermittelte globale Auswirkung auf die Genexpression zeig-ten. Neben Phosphatidylglycerin, als Substrat für die Phospholipase RssA, konnte außerdem das strukturell sehr ähnliche Cardiolipin als ein zusätzliches Substrat für RssA identifiziert werden. Ein weiteres Beispiel für einen „nicht-orthodoxen“ Regulationsmechanismus, der innerhalb dieser Arbeit untersucht wurde, ist die Verbindung des YcgF/YcgE-Signaltransduktions-systems mit dem Rcs-System durch das kleine Protein YmgB. YmgB steht unter Kontrolle des YcgF/YcgE – Signaltransduktionsweges. Nach Induktion des Proteins wurde ein mukoi-der Phänotyp und eine Reduktion der Expression der Curlisynthesegene beobachtet (Tschowri et al., 2009). Dieser mukoide Phänotyp wird durch die Ausbildung der Kolansäure (ein Kap-selbestandteil) hervorgerufen und resultiert aus der Aktivierung des Rcs-Systems. Mit Mikro-arrayanalysen konnte gezeigt werden, dass YmgB eine Vielzahl Rcs-abhängiger Gene regu-liert, zu denen auch die Curlisynthesegene zählen. Die Rcs-Komponenten selbst wurden je- doch nicht in ihrer Expression beeinflusst. Demzufolge scheint das YmgB- Protein als eine Art Konnektor die Aktivität der Rcs-Komponenten zu modulieren. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass RcsB seine Wirkung nicht nur auf direktem Wege als Transkriptionsfaktor ausübt, sondern auch indirekt über die Aktivierung der kleinen RNA RprA wirken kann. Im Falle des Transkriptionsregulators der Curlisynthesegene, CsgD, ist alleinig RprA für die Repression von csgD verantwortlich. Dabei werden offenbar zwei Bindestellen innerhalb der 5`UTR der csgDmRNA von RprA für die Regulation genutzt. Eine mit der Ribosomenbindestelle überlappende Bindestelle dient der Translationsregulation von csgD durch RprA. Eine wesentlich größere regulatorische Rolle scheint jedoch die weiter stromaufwärts vom Translationsstart liegende Bindestelle zu spielen. Vorläufige Untersu-chungen deuten dabei auf eine Rolle bei der Transkriptionselongation. Innerhalb dieser Arbeit konnte somit erstmalig gezeigt werden, dass der Transkriptionsregulator der Curlisynthesege-ne, CsgD, der direkten Kontrolle der kleinen RNA RprA unterliegt und dass diese posttranskriptionale Regulation offenbar durch zwei unterschiedliche Mechanismen gewähr-leistet wird. Damit wurde unter anderem demonstriert, dass nicht immer Responseregulatoren selbst für eine Zielgenregulation verantwortlich sind, sondern dies, wie hier gezeigt, auch über kleine RNAs realisieren können. Mit den Ergebnissen dieser Arbeit wird einmal mehr deutlich, dass neben der „orthodoxen“ Aktivierung eine Vielzahl „nicht-orthodoxer“ Wege der Aktivitätsregulation von Zweikom-ponentensystemen existieren und dass durch diese komplexen Regulationsmöglichkeiten eine optimale und fein abgestimmte Anpassung der Bakterien an die unterschiedlichsten Umwelt-bedingungen erfolgen kann.
Summary Two component systems are important systems in bacteria, which allow an adaptation to un-favourable environmental conditions. Usually an activation of two component systems is car-ried out by the activation of the sensor kinase through an external signal, subsequent auto-phosphorylation at its conserved histidin residue, followed by the phosphotransfer to an aspar-tate residue within the cognate response regulator. Phosphorylation induces a conformational change in the response regulator. Many response regulators are DNA-binding proteins which, as a result of phosphorylation, function as transcription factors that influence the expression of target genes. Besides this “orthodox” activation (phosphotransfer from sensor kinase to response regulator) an increasing number of so called “unorthodox” activation pathways of two component systems have recently been characterized. Crosstalk represents one example of “unorthodox” regulation within two component systems. In addition to the phosphotransfer to their partner response regulators, some sensor kinases are able to phosphorylate other response regultators under certain conditions (Groban et al., 2009; Mika et al., 2005). Furthermore, recently described so called connectors can have di-verse influences on the activity of two component system proteins. Connectors are usually small proteins, which are induced by a specific signal transduction pathway and exert a regu-latory influence on other systems, such as two component systems. In this thesis three additional “unorthodox” mechanisms of regulation within two component systems could be identified and/or characterized in detail. First, lysophosphatidylgycerol (LPG) was identified as a new effector molecule which regu-lates sensor kinases and therefore two component systems. It could be demonstrated that lysophosphatidylglycerol, which is generated by RssA upon cleavage of phosphatidylglycerol, inhibits autophosphorylation of the sensor kinases ArcB, BarA, BaeS and RstB in vitro. Free fatty acids, which are also generated by RssA-mediated lysophosphatidylglycerol cleavage, do not influence the autophosphorylation of the sensor kinase ArcB. Preliminary evidence for an in vivo role of LPG was obtained by microarray analysis, which showed an RssA/LPG mediated global role in gene regulation. In addition to phosphatidylglycerol, the phospholipase RssA can also use cardiolipin as a sub-strate, which shows a very similar structure to phophatidylglycerol. The connection of the YcgF/YcgE signal transduction pathway with the Rcs-system via the small protein YmgB, which was also investigated in this thesis, is another example of an “un-orthodox” mechanism of regulation within two component systems. YmgB is under control of the YcgF/YcgE–signal transduction pathway. Induction of YmgB leads to a mucoid pheno-type and the reduction of curli synthesis gene expression (Tschowri et al., 2009). The mucoid phenotype is caused by production of colonic acid (a capsule component) as a result of an activated Rcs-system. Microarray analysis revealed many YmgB-regulated genes, including the curli synthesis genes and a large number of RcsB-dependent genes. However the expres-sion of the Rcs- components itself was not influenced by YmgB. Thus YmgB functions as a connector which modulates the activity of the Rcs-components. Furthermore, it could be demonstrated here that RcsB does not only exert its influence on target genes directly as a transcription factor, but also indirectly influences gene expression via activation of the small RNA RprA. In the case of the curli regulator CsgD, the repression is mediated exclusively via the small RNA RprA. Two possible binding sites within the 5`UTR of csgDmRNA seem to be used by RprA for this regulation. One of the binding sites is overlapping with the ribosome binding site and is responsible for translational regulation of csgD by RprA. The other one is located further upstream of the translational start site and seems to play the major regulatory role. Preliminary results suggest a role of this binding site in transcriptional elongation. This thesis provides the first evidence that the transcriptional regulator of the curli synthesis genes, CsgD, is under direct control of the small RNA RprA and that this posttranscriptional regulation is probably ensured by two different mechanisms. This demonstrates that the regulation of target genes by response regulators can also be medi-ated indirectly, for example via a small RNA. The present study provides additional evidence for the existence of “unorthodox” pathways of activity regulation within two component systems, which act parallel to the “orthodox” pathways. These complex mechanisms of regulation ensure an optimal and fine tuned adapta-tion of microorganisms to diverse environmental conditions.
