Generierung eines humanen isogenen FlpIn -Expressions-Zelllinienpanels mit Hilfe von AAVS1-Zinkfinger-Nukleasen zur Untersuchung von Kandidatengenen bei kardiometabolischen Erkrankungen

Abstract

Kardiovaskuläre Erkrankungen sind die führende Todesursache weltweit. Die Suche nach genetischen Einflussfaktoren und die Entwicklung neuer gentherapeutischer Ansätze beeinflusst seit langem maßgeblich die Wissenschaft. Besonderes Interesse gilt der Entdeckung neuer Kandidatengene und deren funktioneller Untersuchung mittels biochemischer Verfahren. Um funktionelle Konsequenzen kontextspezifisch analysieren zu können, besteht Bedarf in der Entwicklung zuverlässiger Methoden für die präzise Veränderung des Genoms vitaler Zellen. Langfristig sollen diese Methoden auch für personalisierte Medizin und gentherapeutische Nutzung anwendbar sein. In vorangegangenen Arbeiten wurde das Einbringen ausgewählter DNA-Abschnitte (Inserts) in das Genom vitaler Zellen demonstriert. Es zeigte sich der Wunsch nach gezieltem Einbau eines Inserts einmalig an vordefinierter Stelle im Zellgenom. Als solcher Integrationsort hat sich der “safe harbor” AAVS1 Locus auf dem menschlichen Chromosom 19 etabliert, da er den Vorteil der durchgängigen Expression und Unabhängigkeit gegenüber benachbarten Genen aufweist. Da die Sequenz des AAVS1 Locus bekannt ist, kann er mittels homologer Rekombination (HR) angesteuert werden. Die naturgemäß niedrige HR- Rate kann durch die Erzeugung eines DNA-Doppelstrangbruchs (DSB) gesteigert werden. In der vorliegenden Arbeit wird eine neue Methode zur Erzeugung eines Zelllinienpanels dargestellt, welches zukünftig zelltypspezifische Untersuchungen von Kandidatengenen ermöglichen wird. Es wurde der komplexe Vektor AAVS1-LacZeo2 hergestellt, welcher als Integrationsplattform die FRT- Site des weltweit häufig genutzten Integrationssystems FlpIn-System (Invitrogen) sowie zum AAVS1 Locus homologe Sequenzen enthält. Der Vektor wurde via HR in HEK293, HUVEC und HepG2 Zellen integriert. Hierbei wurde mittels Zinkfingernukleasen (ZFNs) ortsspezifisch im AAVS1 Locus ein DSB erzeugt. So konnten FRT-Zelllinien geschaffen werden. Zudem konnte auch die Funktionalität der FRT-Site demonstriert werden indem ein GFP-Insert via FRT- Site in den AAVS1 Locus integriert wurde. Die FRT-Site erlaubt die ortsspezifische Integration eines beliebigen Gens (gene of interest, GOI) mit Hilfe einer FLP-Rekombinase in das Genom der FRT-Zelle. Aufgrund der Positionierung der FRT-Site im AAVS1 Locus sind die erzeugten Zelllinien untereinander vergleichbar und eine zelltypspezifische Untersuchung von Kandidatengenen ist möglich. In den AAVS1 Locus des zweiten Chromosoms 19 wurde über HR ein Tetrazyklin-gesteuerter Tet-Repressor (M2rtTA) eingefügt. Dieser erlaubt über die Änderung der Doxyzyklinkonzentration im Zellkulturmedium die gezielte Regulation der GOI-Expression. Die präsentierte Methode bildet die Grundlage für die Etablierung weiterer FRT-Site-tragender Zelllinien und deren Nutzung in der kardiometabolischen Forschung.

Cardiovascular diseases constitute the leading cause of death globally. Searching for genetic factors and developing new approaches in gene therapy has great impact on research. Special interest is paid to discovering new candidate genes and performing their functional analysis using biochemical methods. To enable further analysis of functional consequences in specific contexts it is necessary to develop solid methods for precise genome manipulation in a living cell. In the long term this method may be applied for personalized medicine and gene therapy. Previous studies demonstrate the insertion of specific DNA-sequences (called “inserts”) into the genome of a living cell. This led to demand of directed insertion of an insert at a single chosen location in the genome of the targeted cell. For this purpose the “safe harbor” AAVS1 locus, located on chromosome 19, has proven useful, since this locus is ubiquitously expressed and independent of nearby genes. As the sequence of the AAVS1 locus is well- characterized the locus can be targeted by homologous recombination (HR). Naturally the rate of HR is low, but can be increased significantly by creating a DNA double-strand break (DSB). The present study presents a new approach for generating cell line panels that will allow cell type specific analysis of candidate genes. The complex vector AAVS1-LacZeo2 was created. As an integration platform it includes the FRT-site of the worldwide most commonly used integration system FlpIn (Invitrogen), as well as sequences homologous to the AAVS1 locus. The vector was integrated in HEK293, HUVEC and HepG2 cells by HR. Therefor zinc finger nucleases (ZFNs) were used to create a DSB in the AAVS1 locus. The creation of FRT-cells was demonstrated successfully. In addition functionality of the FRT-site was demonstrated by integrating a GFP-insert into the AAVS1 locus using site- specific integration. The FRT-site enables site-specific integration of any gene of interest (GOI) into the genome of the FRT-cell using FLP-recombinase. Because of the FRT-site-positioning in the AAVS1 locus created FRT-cell lines are comparable among each other and a cell type specific analysis of candidate genes is possible. Into the AAVS1 locus of the second chromosome 19 a tetracycline-controlled tet-repressor (M2rtTA) was integrated by HR. It allows the specific regulation of the GOI-expression through variation of the amount of doxycycline in cell culture medium. The presented results provide a basis for the development of further FRT-cell lines and their use for cardiometabolic research.