Investigation of the effects of selenium and selenoproteins on the activation of microglia and on the protection of brain cells in oxidative stress

Abstract

This study focused on the regulation of microglial activation under oxidative stress conditions by the trace element selenium. In response to the cellular damage induced by oxidative stress, the microglial cells become activated and produce large amounts of free radicals of oxygen, nitrogen oxides and toxic cytokines, which contribute to the secondary neuronal damage and account for most of the losses of the brain functions. The findings of this study demonstrate that hydrogen peroxide-induced microglial activation and deleterious correlated events can be attenuated by selenium through the downstream regulation of intracellular mechanisms, such as the production of ROS, the activation of caspase-3, the nuclear translocation of NF-kB and the activation of iNOS. The activation and migration of microglial cells were also shown to be regulated by the incubation with physiological concentrations of selenium: the FACS analysis showed a decreased expression of the ß2-integrin CD11a after pre-incubation with selenium. By means of 75Se-labelling and electrophoresis, the selenoproteome of BV2 cells was analysed. After two- dimensional electrophoresis more than 25 labelled spots were detected in the microglial cells. Some selenoproteins could be identified by comparison with the results of previous studies. All the observed events were related to the capability of selenium to stimulate the expression of the microglial selenoproteins. In particular, selenium administration increased the Gpx1 activity in BV2 cells, as evidenced by the tracer experiments with 75Se and by enzyme activity measurements. Thus, it was likely that selenium could act by scavenging free radicals through an increase in the Gpx1 activity (resulting in the inhibition of the microglial activation induced by hydrogen peroxide). Novel plasmids were constructed for the down-regulation and over-expression of the Gpx1 protein. The over-expression was achieved by cloning a Gpx1-EGFP-C1 vector, which was successfully transfected in BV2 cells and was able to produce recombinant Gpx1-EGFP protein. This also allowed the analysis of the subcellular localization of the protein by confocal microscopy in COS-7 cells. The silencing of the Gpx1 activity was achieved by using the siRNA technology. Target sequences were accurately selected and at the end of the cloning process in the pSUPER vector, one functional plasmid was obtained. The Gpx1-pSUPER-142 vector was able to reduce efficiently and exclusively the Gpx1 protein expression in microglial cells, shown by the selenoproteome analysis of the transfected cells. The silencing of the Gpx1 confirmed that this protein is one of the fundamental proteins by which selenium acts in the protection of microglial cells. The essential role of the selenium status was also confirmed in experiments with primary microglial cells isolated from rats fed a selenium-sufficient or a selenium-deficient diet. Thus, this work helped to elucidate some of the intracellular mechanisms by which selenium produces protective responses via the modulation of toxic events in microglial cells. The results support the use of selenium as a therapeutic agent against the microglial over-activation, which occurs in many neurodegenerative diseases and contributes to the secondary neuronal cell death.

In dieser Arbeit wurde der Einfluss des Spurenelements Selen auf die Aktivierung von Mikroglia unter oxidativem Stress untersucht. Mikrogliazellen sind intrinsische Gehirnmakrophagen. Als Antwort auf zelluläre Schädigung durch oxidativen Stress werden ruhende Mikroglia aktiviert und reagieren mit morphologischen und funktionellen Veränderungen. Die aktivierten Mikrogliazellen produzieren große Mengen freier Sauerstoff- und Stickstoffradikale sowie toxische Zytokine. Diese massive Freisetzung toxischer Produkte kann nicht nur auf die Mikroglia selbst schädigend wirken, sondern vor allem auch auf Neuronen (Sekundärschädigung). Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Wasserstoffperoxid-induzierte Mikrogliaaktivierung und deren Folgen durch Selenzugabe verhindert bzw. abgemildert werden kann. Selen verhinderte die Produktion von freien Sauerstoffradikalen (ROS) in Mikroglia, die Aktivierung von Caspase-3, die Kerntranslokation des Transkriptionsfaktors NF-kB und die induzierbare NO- Synthase (iNOS) -Aktivierung. Es wurde auch gezeigt, dass physiologische Konzentrationen von Selen die Aktivierung und Migration der Mikroglia beeinflussen: Durchflusszytometrie-Analysen zeigten eine verringerte Expression des ß2-Integrins CD11a nach Vorinkubation mit Selen. Selen reguliert die CD11a-Expression in aktivierten Mikrogliazellen, die notwending ist für die spezifische Migration zum Ort der neuronalen Schädigung. Durch 75Se-Markierung und Elektrophorese wurde das Selenoproteom der BV2-Zellen analysiert. Nach zwei-dimensionaler Elektrophorese wurden mehr als 25 markierte Spots in der Mikroglia-Zellen gefunden. Einige Selenoproteine konnten durch Vergleich mit den Ergebnissen früherer Studien identifiziert werden. Alle diese Ereignisse sind mit der Fähigkeit des Selens korreliert, die Expression von Selenoproteinen zu stimulieren. Die Zugabe von Selen steigerte in BV2-Zellen insbesondere die Gpx1-Aktivität, wie durch Traceruntersuchungen mit 75Se und Enzymaktivitätsmessungen gezeigt werden konnte. Es ist deshalb wahrscheinlich, dass Selen durch Erhöhung der Gpx1-Aktivität eine H2O2-induzierte Mikrogliaaktivierung hemmen kann. Um die Rolle der Gpx1 in Mikrogliazellen aufzuklären, wurden Zellen produziert, in denen die Expression dieses Enzyms erhöht oder reduziert war. Dafür wurden zunächst Vektoren für die Überexpression oder Hemmung von Gpx1 kloniert. Die Sequenz der Gpx1 wurde in einen EGFP-C1-Vektor kloniert. Auf diese Weise konnte das Enzym nach Transfektion von BV2-Zellen überexpremiert werden. Außerdem diente die GFP-Markierung der subzellulären Lokalisation des Fusionsproteins mittels Konfokalmikroskopie in COS-7 Zellen. Die Verringerung der Gpx1-Expression wurde mittels der siRNA Technologie erreicht. Nach sorgfältiger Auswahl der Target-Sequenzen und deren Klonierung in einen pSUPER-Vektor konnte ein funktionelles Konstrukt isoliert werden. Die Analyse des Selenoproteoms nach der Transfektion zeigte, dass der Gpx1-pSUPER-142 Vektor effizient und gezielt die Expression dieses Enzyms in den Mikrogliazellen reduzieren konnte. Der Knock-Down des Gpx1-Proteins bestätigte, dass der Schutzeffekt von Selen bei den Mikrogliazellen vor allem auf der Wirkung der Gpx1 beruht. Die essentielle Rolle von Selen wurde auch durch Experimente an primären Mikrogliazellen von Ratten bestätigt, die entweder selenadäquat oder mit einer Selen-Mangeldiät ernährt worden waren. Durch die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen konnte aufgeklärt werden, wie das Spurenelement Selen durch die Modulation toxischer Reaktionen Mikrogliazellen beeinflusst und schützt. Aufgrund dieser Ergebnisse besteht die Möglichkeit, Selen therapeutisch gegen die Überaktivierung von Mikrogliazellen einzusetzen, die zur sekundären Schädigung von Neuronen führt und in verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen eine Rolle spielt.