Mutational scanning of CLOCK exon 19 transactivation domain

Abstract

In mammalian circadian clocks, the CLOCK:BMAL1 heterodimer transactivates E-box enhancer elements to regulate the transcription of circadian clock targets. The CLOCK exon 19 deletion (CLOCKΔ19) lacks 51 amino acids and exhibits an arrhythmic phenotype. For more than 27 years, we had no clear insight into the essential amino acids of CLOCK exon 19-domain that are required for normal transactivation. To investigate this, we developed a CLOCK rescue system based on a human-derived reporter cell line with CLOCK-knockout using CRISPR/Cas9 technology. We performed alanine mutation scanning for the entire exon 19-domain. The CLOCK-knockout cell line is arrhythmic, and the rhythmic phenotype was rescued by transduction with wild-type CLOCK but not with CLOCK∆19. We identified 10 CLOCK variants that recapitulate the deletion of exon 19, suggesting that these residues are essential for CLOCK protein functionality. We also identified certain residues where mutations shortened the period. Some of those mutations showed a dominant phenotype in wild-type cell line. Interestingly, many of the identified mutations play a role in the hydrophobic interaction of the predicted dimer of CLOCK exon 19-domains. These results reveal critical residues responsible for CLOCK functionality. Our data also indicate the importance of exon 19-domain dimerization to serve as a platform for activator and repressor binding, which is critical for normal circadian rhythms.

In zirkadianen Uhren von Säugetieren transaktiviert das CLOCK:BMAL1-Heterodimer E-Box-Enhancer-Elemente, um die Transkription zirkadian exprimierter Zielgene zu regulieren. Der CLOCKΔ19-Mutante fehlen 51 Aminosäuren und sie weist einen arrhythmischen Phänotyp auf. Mehr als 27 Jahre lang fehlte ein klarer Einblick, welche Aminosäuren des CLOCK-Exons 19 für eine normale Transaktivierung erforderlich sind. Um dies zu untersuchen, haben wir ein CLOCK-Rescue-System entwickelt, das auf einer humanen, mittels CRISPR/Cas9-Technologie generierten CLOCK-Knockout- Reporterzelllinie basiert. Die CLOCK-Knockout-Zelllinie ist arrhythmisch, und der rhythmische Phänotyp wurde durch Transduktion mit Wildtyp-CLOCK, nicht aber mit CLOCKΔ19 Rescue. Mittels Alanin-Mutationsscanning konnten wir 10 CLOCKVarianten identifizieren, die die Deletion von Exon 19 rekapitulieren, was darauf schließen lässt, dass diese Reste für die Funktionalität des CLOCK-Proteins wesentlich sind. Des Weiteren konnten wir Punktmutationen identifizieren, die die Periode verkürzten. Einige dieser Mutationen zeigten einen dominanten Phänotyp in Wildtyp-Zelllinien. Viele dieser Reste spielen eine Rolle bei der hydrophoben Interaktion eines postulierten Dimers der CLOCK-Exon-19-Domänen. Diese Studie identifiziert somit entscheidende Aminosäurereste, die für die Funktionalität von CLOCK verantwortlich sind. Unsere Daten deuten zudem darauf hin, wie wichtig die Dimerisierung des Exons 19 ist, um als Plattform für die Bindung von Aktivatoren und Repressoren zu dienen, was für normale zirkadiane Rhythmen entscheidend ist.