Leukocyte opioid receptors mediate analgesia via Ca2+-regulated release of opioid peptides

Abstract

Opioids are the gold standard for treatment of moderate to severe pain. Traditionally, opioids produce analgesia by regulating both pre- and post- synaptic neurons via blocking Ca2+ influx, consequently inhibiting the release of excitatory neurotransmitters (e.g., glutamate) and by hyperpolarizing the synaptic membrane via decreasing intercellular K+ concentrations. Even though the number of prescriptions for opioids has greatly increased in the last decade, there are major problems with opioids due to their central side affects, such as respiratory depression and addiction, which might be avoided by peripheral administration of the opioids. Circulating leukocytes also produce opioid peptides and opioid receptors during injury and they accumulate at the inflammation site. Here we show that the activation of opioid receptors on leukocytes leads to the secretion of leukocyte derived endogenous opioid peptides Met-enkephalin, β- endorphin and dynorphin A, which bind to the local opioid receptors on peripheral sensory neurons to cause analgesia. As a model of neuropathy, chronic constriction injury of the sciatic nerve was performed on mice, which caused mechanical hypersensitivity. Pain was attenuated by the application of exogenous agonists of the δ-, μ-, and κ-opioid receptors at the injury site, which was infiltrated by opioid peptide containing leukocytes. The analgesic effect was abolished by systemic leukocyte depletion and pharmacological inactivation of opioid peptides. In addition, agonist-induced pain relief was attenuated on opioid peptide knock-out mice. Adoptive transfer of leukocytes from wild-type into leukocyte depleted mice reconstituted agonist-induced analgesia in vivo. Analgesia could not be reconstituted when leukocytes were transferred from opioid receptor knock-out mice. Ex vivo, opioid receptor agonists significantly elevated the secretion of opioid peptides from leukocytes isolated from damaged nerves. This secretion was dependent on intracellular Ca2+ and blocking Gαi/o and Gβγ subunits, PLC and IP3 receptor decreased the opioid peptide secretion back to the basal levels while PKC inhibition only had a partial effect. Similarly, leukocyte depletion resulted in the decrease of exogenous opioid analgesia in vivo. The analgesic effects could be re-established by transfer of leukocytes ex vivo pretreated with extracellular Ca2+ chelator, but was unaltered when leukocytes were pretreated with blockers of Gαi/o, Gβγ proteins or intracellular Ca2+ chelator. These findings demonstrate that both in vivo analgesia and ex vivo opioid peptide release were mediated by opioid receptors on leukocytes coupled to the Gαi/o–Gβγ protein–PLC–IP3 receptors pathway and dependent on intracellular Ca2+ which can be identified as an unconventional mechanism of pathological pain control.

Opioide sind der Goldstandard zur Behandlung von mittelstarken bis starken Schmerzen. Gemäß der klassischen Sichtweise bewirken sie eine Analgesie über die Regulation prä- und postsynaptischer Neuronen durch die Blockade des Ca2+-Einstroms, und somit die Freisetzung exzitatorischer Neurotransmitter (z.B. Glutamat), sowie durch Hyperpolarisierung der synaptischen Membran über die Herabsetzung der intrazellulären K+-Konzentration. Die Anzahl der Verschreibungen von Opioiden ist innerhalb des letzten Jahrzehnts stark angestiegen, obwohl die Anwendung von Opioiden schwerwiegende, über das zentrale Nervensystem vermittelte Nebenwirkungen wie Atemdepression und Abhängigkeit zeigt. Diese Nebenwirkungen können möglicherweise durch die periphere Verabreichung von Opioiden umgangen werden. Immunzellen, welche sich an Verletzungen und Entzündungsherden anreichern, exprimieren Opioidrezeptoren und Opioidpeptide. In dieser Studie zeigen wir, dass die Aktivierung von Opioidrezeptoren auf Immunzellen diese zur Sekretion der endogenen Opioidpeptide Met- Enkephalin, β-Endorphin und Dynorphin A veranlasst, welche wiederum lokal Opioidrezeptoren auf peripheren sensorischen Neuronen binden und darüber eine Analgesie bewirken. Als Modell für neuropathischen Schmerz wurde eine chronische Kontstriktionsläsion des Ischiasnerves an Mäusen durchgeführt, welche zu mechanischer Hypersensitivität in der Pfote führte. Die lokale Verabreichung exogener Agonisten der δ-, μ- und κ-Opioidrezeptoren nahe der Verletzung und in der Gegenwart Opioidpeptid-exprimierender Immunzellen führte zu einer Schmerzminderung. Eine systemische Entfernung von Immunzellen sowie eine pharmakologische Inaktivierung von Opioidpeptiden führten zur Aufhebung dieses analgetischen Effekts. In Opioidpeptid-Knockout Mäusen war zudem die Schmerzlinderung durch lokal applizierte Opioidrezeptor- Agonisten verringert. In Immunzell-depletierten Mäusen führte ein Transfer von Immunzellen aus Wildtyp, nicht aber aus Opioidrezeptor-Knockout Mäusen zur Wiederherstellung der Opioid-induzierten Analgesie in vivo. Ex vivo bewirkten Agonisten der Opioidrezeptoren eine verstärkte Sekretion von Opioidpeptiden durch zuvor aus geschädigten Nerven isolierte Immunzellen. Die Peptidsekretion war abhängig von intrazellulärem Ca2+. Eine Blockade der Gai/o und Gbg Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine, der PLC und des IP3-Rezeptors führten zu einer auf basale Werte reduzierten Peptidsekretion, während eine Inhibition der PKC einen nur teilweise mindernden Effekt auf die Sekretion zeigte. Analog dazu konnte der analgetische Effekt lokal applizierter Opioide in Immunzell-depletierten Mäusen durch den Transfer von Immunzellen wiederhergestellt werden, wenn die Immunzellen ex vivo mit einem Chelator für extrazelluläres Ca2+ behandelt wurden, nicht aber nach Behandlung der Immunzellen mit Inhibitoren der Gαi/o- und Gβγ Proteine oder einem Chelator für intrazelluläres Ca2+. Diese Ergebnisse zeigen, dass Opioidrezeptoren auf Immunzellen über den Signalweg Gαi/o–Gβγ Protein–PLC–IP3 Rezeptor, abhängig von intrazellulärem Ca2+, ex vivo die Sekretion von Opioidpeptiden und in vivo Analgesie vermitteln. Dieser Signalweg stellt einen unkonventionellen Mechanismus zur Kontrolle pathologischer Schmerzen dar.