The role of DJ-1 in neurodegeneration and aging in a Drosophila model of Parkinson’s Disease and its implications for novel neuroprotective therapies

Abstract

Background Most current pharmacological treatments for Parkinson’s Disease (PD) alleviate symptoms without reversing disease progression. Pathogenic factors for PD include oxidative stress, inflammation and excitotoxicity. Manipulation of these factors may allow the development of disease-modifying treatment strategies. Identification of rare monogenetic forms of Parkinson`s (PARK1-11) has enabled the creation of genetic animal models. PARK7 is caused by mutations in the DJ-1 gene. The aim was to describe the phenotype of a newly generated Drosophila-DJ-1-model and use it for testing potentially disease modifying drugs. In addition to the PARK7 studies, two new Drosophila clones (PINK1 and hMARK2), relevant to PARK6, were to be engineered and transgenic lines established. Methods The DJ-1 phenotypes were used in assays on neurodegeneration, lifespan and resistance to exogenous toxins. The accelerated degeneration of dopaminergic neurons (DN) in DJ-1-deficient flies was assessed by histological staining of neurons immunopositive to anti- tyrosine-hydroxylase (TH) at different fly ages. Brain dopamine content was measured in brain homogenates by HPLC. For life span studies DJ-1 function was selectively over-expressed or inhibited in various body tissues by specific promoters. Survival curves were plotted. Mutants were exposed to reactive oxygen species and metal compounds. Survival was plotted. Drugs were fed in yeast paste. The Chinese herb celastrol, the antibiotic minocycline, the bioenergetic amine coenzyme Q10 (coQ10), and the glutamate antagonist 2,3-dihydroxy-6-nitro-7-sulphamoylbenzo[f]-quinoxaline (NBQX) were used. Numbers of TH-positive cells were visualized immunohistochemically. Brain dopamine concentrations were measured by HPLC. To establish new downregulated and overexpressing lines, the RNA interference technique and upstream activating sequences were introduced. Plasmids containing the gene-of-interest were amplified in bacteria and purified. Genes were isolated by sequential digests and cloned into the pUAST-vector. Chemically competent cells were transformed with the pUAST-clone. The pUAST-clone was injected into the pre- germ cells of wild-type fly embryos. The generated flies were crossed to balancer chromosome-bearing flies to establish stable lines. Results Loss of DJ-1 function resulted in age-dependent loss of dopaminergic neurons as well as in dopamine depletion. Secondly, loss of DJ-1 function resulted in shortened lifespans and hypersensitivity to exogenous toxins. Overexpression of DJ-1 produced resistance to external toxins. The drugs celastrol and minocycline, both having antioxidant and anti-inflammatory properties, conferred potent dopaminergic neuroprotection, while coQ10 showed no effect. NBQX exerted differential effects. Conclusions: The results support the hypothesis of DJ-1 playing a role in cellular protection and repair mechanisms. Drugs combining antioxidant and anti-inflammatory properties hold therapeutic potential for mechanism-based PD treatments.

Einleitung Die meisten gegenwärtigen Behandlungen des Morbus Parkinson (PD) führen zu einer zeitlich limitierten Symptomkontrolle, ohne Einfluss auf das Fortschreiten der Erkrankung zu nehmen. Oxidativer Stress, Inflammation und Exzitotoxizität sind bekannte pathogenetische Faktoren für die Entstehung PD. Ihre Modifikation bildet einen krankheitsmodifizierenden Therapieansatz. Die Identifizierung familiärer monogenetischer Parkinsonformen (PARK1-11) hat die Entwicklung genetischer Tiermodelle ermöglicht. PARK7 wird durch Mutationen im sogenannten DJ-1 Gen bedingt. Ziel war es, den Phänotyp eines neu entwickelten DJ-1-Drosophila Modells zu beschreiben und dann zur pharmakologischen Testung potentiell krankheitsmodulierender Medikamente zu nutzen. Zusätzlich sollten zwei weitere Drosophila-Klone (PINK1 und hMARK2) als neue Parkinsonmodelle konstruiert und stabile transgene Linien generiert werden. Methodik Der Drosophila-DJ-1-Phänotyp wurde in Bezug auf Neurodegeneration, Überleben und Resistenz gegenüber oxidativem Stress analysiert: Die dopaminerge Degeneration wurde immunhistochemisch an Hirnschnitten mit anti-Tyrosin-Hydroxylase- Antikörper-Färbungen und metabolisch mittels HPLC für Dopamin gemessen. Überlebenskurven wurden ermittelt, nachdem die Expression von DJ-1 mithilfe geeigneter Promotoren gewebespezifisch hoch- oder herunterreguliert wurde. Ferner wurden Überlebenskurven aufgezeichnet, nachdem die Fliegen exogenen oxidativen Stressoren ausgesetzt wurden. Die potentiell neuroprotektiven Substanzen wurden der Fliege in Hefepaste dargeboten. Das chinesische Kraut Celastrol, das Antibiotikum Minocyclin, das biogene Amin Coenzym Q10 und der Glutamatanatgonist 2,3-dihydroxy-6-nitro-7-sulphamoylbenzo[f]-quinoxaline (NBQX) wurden verwandt. TH-positive Neurone und Dopaminkonzentrationen wurden nach der Behandlung ermittelt. Um neue transgene Linien zu schaffen, wurden die RNA-Interferenztechnik und Promotor-kontrollierte Transkriptionsfaktoren benützt. Die das jeweilige Gen enthaltenden Plasmide wurden in Bakterien vermehrt. Das Gen wurde mittels sequentieller Restriktionsverdaue isoliert und in den pUAST Vektor geklont. Die Klone wurden erneut in Bakterien vermehrt, gereinigt und in die Prä-Gonaden von Fliegenembryonen injiziert. Die geschlüpften Fliegen wurden mehrmals mit Balancer-Chromosom-tragenden Fliegen gekreuzt, bis stabile transgene Linien entstanden. Ergebnisse Der Verlust der DJ-1 Funktion führte in der Fliege zu einer Degeneration dopaminerger Neurone und zur Transmitterdepletion, sowie zu verkürzter Lebenszeit und Überempfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress. Überexpression von DJ-1 hingegen führte zu Stressresistenz. Die beiden sowohl antioxidativ als auch antiinflammatorisch wirkenden Substanzen, Celastrol und Minocyclin, zeigten einen deutlichen neuroprotektiven Effekt in der Fliege. Coenzym Q10 zeigte keine Wirkung auf die Neurodegeneration. NBQX zeigte divergierende Effekte. Schlussfolgerung Die Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass DJ-1 eine Rolle bei zellulären Schutz- und Abwehrmechanismen spielt. Substanzen mit antioxidativer und antiinflammatorischer Wirkung tragen ein neuroprotektives/neurorestauratives Potential in der Behandlung des PD.