Investigation of the genetical basis of autosomal recessive Cutis Laxa

Abstract

Autosomal recessive cutis laxa (ARCL) is a highly heterogeneous group of disorders, which is mainly associated with a progeroid appearance, lax and wrinkled skin, mental retardation and osteopenia and whose pathogenesis is only partially unravelled. After excluding mutations in the human ARCL genes, GORAB and ATP6V0A2, in the patients of our ARCL cohort without lung involvement, we conducted further genetic analysis in consanguineous families. These families were formerly diagnosed as GO, ARCLII-WSS and de Barsy syndrome. Homozygocity mapping in ten kindreds revealed a candidate region on chromosome 17q25. Sequencing of several genes in the candidate region resulted in the identification of disease-causing mutations in the gene PYCR1, encoding for Δ1-pyrroline-5-carboxylate reductase, an enzyme which catalyzes the final step of the de novo synthesis of proline. In total, 22 families of our ARCL cohort were found to bear missense, frameshift and splice site but no nonsense mutations. Apart from the common features of all ARCL forms, intrauterine growth retardation, mental retardation and a typical facies were the constant findings in these patients. Brain and eye abnormalities such as agenesis of corpus callosum and cataract were also evident. Proline levels, measured in serum and cell lysates from patients with mutations in PYCR1 did not reveal significant changes when compared with control samples. Affected individuals showed a pronounced progeroid appearance, which was not progressive. The detection of mutations in patients diagnosed as de Barsy syndrome implies that PYCR1 is one of the genes responsible for this genetically heterogeneous phenotype. All mutations found were associated with a decrease of protein expression in patient fibroblasts. Furthermore, immunofluorescence studies revealed a mitochondrial residence of the protein, as PYCR1 was found to co- localize with specific mitochondrial marker proteins. Immunofluorescence analysis provided evidence for an altered mitochondrial morphology upon loss of PYCR1, which was further confirmed by electron microscopy. The alterations were found to become more severe after transient treatment with H2O2 resulting in a five-fold increase in the number of fragmented mitochondria in patient cell lines. Upon oxidative stress the fibroblasts with mutations in PYCR1 showed higher apoptosis rates compared to control cells. Our findings suggest that PYCR1 contributes to the maintenance of the normal mitochondrial morphology and protects against oxidative stress, most probably by inhibiting apoptosis. This study postulates a new association between mutations in PYCR1, altered mitochondrial function and progeroid changes in connective tissues.

Die autosomal rezessive Cutis laxa (ARCL) ist eine sehr heterogene Gruppe von Erkrankungen, die hauptsächlich durch einen progeroiden Aspekt, laxe und faltige Haut, mentale Retardierung sowie Osteopenie gekennzeichnet sind und deren Pathogenese bisher erst partiell aufgeklärt werden konnte. In zehn konsanguinen Familien, bei denen im Vorfeld Gerodermia Osteodysplastika (GO), Wrinkly Skin Syndrome oder de Barsy Syndrom diagnostiziert, jedoch keine Mutationen nachgewiesen worden waren, führten wir eine Homozygotie-Kartierung durch. In der resultierenden Kandidatenregion auf Chromosom 17q25 wurden nach Sequenzierung mehrerer Gene pathogene Mutationen im PYCR1-Gen entdeckt. PYCR1 kodiert die Δ1-Pyrollin-5-Karboxylat Reduktase, ein Enzym welches für den letzten Schritt der de novo Synthese von Prolin verantwortlich ist. In insgesamt 22 Familien aus unserer Kohorte konnten wir Missense-, Frameshift- und Splicesite-Mutationen, allerdings keine Nonsense-Mutationen in PYCR1 identifizieren. Zusätzlich zu den typischen Merkmalen aller CL Subtypen, fanden sich bei diesen Patienten eine intrauterine Wachstumsverzögerung, eine schwerere mentale Retardierung und eine typische Facies, sowie eine Agenesie oder Hypoplasie des Corpus callosum und eine Katarakt. Die betroffenen Individuen wiesen einen deutlich progeroiden, aber nicht progressiven Phänotyp auf. Eine Hypoprolinämie konnte weder im Serum von Patienten mit PYCR1 Mutationen, noch in Lysaten von betroffenen Hautfibroblasten festgestellt werden. Auch ursprünglich als de Barsy Syndrom diagnostizierte Patienten wiesen Mutationen im PYCR1-Gen auf, was für einen hohe genetische Heterogenität dieses Syndroms spricht. In kultivierten Fibroblasten von Patienten mit einer PYCR1 Mutation fand sich eine verminderte Expression des PYCR1 Proteins. Immunofluoreszenz-Analysen zeigten, dass das PYCR1 Protein mitochondrial lokalisiert ist, da PYCR1 mit spezifischen mitochondrialen Markerproteinen kolokalisiert war. Außerdem wiesen Zellen mit einer PYCR1 Mutation eine veränderte mitochondriale Morphologie auf, was mittels elektronmikroskopischer Analyse bestätigt wurde. Nach Behandlung mit H2O2 waren die beobachteten Veränderungen deutlich ausgeprägter und es zeigte sich eine fünffach erhöhte Anzahl fragmentierter Mitochondrien in Patienten- Fibroblasten. Nach oxidativem Stress lag in Fibroblasten mit PYCR1 Mutationen eine höhere Apoptoserate im Vergleich zu Kontrollzellen vor. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass PYCR1 zur Aufrechterhaltung der normalen mitochondrialen Morphologie beiträgt und gleichzeitig eine protektive Funktion gegen oxitativen Stress ausübt, möglicherweise durch Inhibition von Apoptose. Unsere Studie demonstriert einen neuartigen Zusammenhang zwischen Mutationen in PYCR1, gestörter mitochondrialer Funktion und progeroiden Veränderungen von Bindegewebsstrukturen.