X-linked centronuclear myopathy (XLCNM), also known as myotubular myopathy, is a rare and severe skeletal muscle disorder that manifests with congenital hypotonia and leads to early childhood mortality due to its currently limited therapeutic options. XLCNM is caused by loss-of-function mutations in the gene encoding the lipid phosphatase myotubularin (MTM1), which dephosphorylates the phosphoinositide phosphatidylinositol 3-phosphate [PI(3)P] at endosomal membranes. Among XLCNM pathomechanisms is impaired muscle cell adhesion via integrins, the transmembrane components of focal adhesions (FAs). Integrin subunit β1 (β1-integrin) plays key roles in the formation and maintenance of specialized skeletal muscle adhesions essential to muscle function. Importantly, MTM1-mediated PI(3)P turnover plays a role in the exocytosis of integrins from endosomes to the plasma membrane, yet the impact of MTM1on cell adhesions has not been described in detail. A functional association between MTM1 and phosphatidylinositol 3-kinase C2β (PI3KC2β), a lipid kinase that synthesizes PI(3)P and phosphatidylinositol 3,4-bisphosphate [PI(3,4)P2], was uncovered in mammals when skeletal muscle-specific ablation of PI3KC2β rescued the disease phenotype of XLCNM mouse models. Previous studies have proposed a direct rebalancing of PI(3)P levels by PI3KC2β as the mechanism underlying the rescue of XLCNM. However, the precise mechanistic interplay between MTM1 and PI3KC2β, and its relevance in skeletal muscle physiological and pathological conditions remains elusive. Thus, in this project we aimed to mechanistically characterize this functional interaction in a cell-based context relevant to XLCNM. By pursuing this objective, we intended to gain insights into the molecular pathogenesis of XLCNM and the role of PI3KC2β in this context, serving as a basis for the development of XLCNM therapeutic strategies. For this purpose, the murine myoblast cell line C2C12 was used to generate knockout (KO) cell lines lacking MTM1, PI3KC2β, or both enzymes. In this system, we described that loss of MTM1 led to cell adhesion defects evidenced by decreased cell spreading, number of FAs and surface activated β1-integrin, which functionally resulted in enhanced migration and impaired myoblast differentiation. Cell adhesion defects and correlated functional phenotypes were completely rescued by co-depletion of PI3KC2β. Contrary to the prevailing opinion, we showed that the accumulation of the MTM1 substrate PI(3)P observed in Mtm1KO myoblasts was not normalized upon co-depletion. Instead, we showed that blockage of endocytosis ameliorated adhesion defects in Mtm1KO myoblasts. Data from HeLa cells, included in this dissertation for completeness purposes, showed that PI3KC2β knockdown (KD) leads to impaired active β1 integrin internalization, a phenotype that we mechanistically explained by a role of PI3KC2β in clathrin-mediated endocytosis (CME) of active β1-integrins. Hence, we propose that MTM1 and PI3KC2β play antagonistic roles in the control of active β1-integrin adhesions by respectively mediating recycling to the plasma membrane and internalization via CME. Treatment of MTM1-depleted cells with a newly developed PI3KC2β inhibitor rescued the reported cell adhesion phenotypes, thus establishing proof-of-principle evidence for a PI3KC2β-targeted XLCNM therapy. Altogether, our findings provide insights into cell adhesion defects key to XLCNM pathogenesis in a newly established in vitro model system. Moreover, we uncover a novel function of PI3KC2β in the regulation of integrin adhesions, setting a mechanistic background for its rescue of the XLCNM disease phenotype, an essential step towards the development of therapies targeting PI3KC2β.
Myotubuläre Myopathie (X-linked centrouclear myopathy; XLCNM) ist eine seltene und schwere Skelettmuskelerkrankung, die sich mit angeborener Hypotonie manifestiert und zu frühkindlicher Sterblichkeit führt aufgrund von begrenzten therapeutischen Behandlungsmöglichkeiten. XLCNM wird durch Mutation des für die Phosphatase Myotubularin (MTM1) codierenden MTM1-Gens verursacht, wodurch die zelluläre Funktion von MTM1, die Entfernung des Phosphoinositids Phosphatidylinositol-3-phosphat [PI(3)P] an endosomalen Membranen durch Dephosphorylierung, gestört wird. Einer der XLCNM Pathomechanismen ist die beeinträchtigte Muskelzell-Adhäsion mittels Integrine, die Transmembranproteine in fokalen Zelladhäsionen (FA). Die β1-Integrin-Untereinheit ist von besonderer Bedeutung in der Formation und Aufrechterhaltung von speziellen Skelettmuskel-Zelladhäsionen, welche essenziell sind für eine normale Muskelfunktion. Frühere Studien haben gezeigt, dass MTM1 durch die Konversion von PI(3)P eine Rolle bei der Exozytose von Integrinen aus Endosomen spielt. Inwiefern intrazellulärer Transport der Integrine durch MTM1 an der Bildung und Aufrechterhaltung spezialisierter Zelladhäsionen im Muskel beteiligt ist, ist jedoch unzureichend verstanden. Des Weiteren wurde eine funktionelle Assoziation zwischen MTM1 und der Phosphatidylinositol 3-Kinase C2β (PI3KC2β), einer Lipidkinase, die PI(3)P und Phosphatidylinositol-3,4-bisphosphat [PI(3,4)P2] synthetisiert, in Säugetieren beschrieben, da die skelettmuskelspezifische genetische Ausschaltung von PI3KC2β die XLCNM-assoziierten Krankheitsphänotypen in Mausmodellen revidiert. Frühere Studien haben eine Normalisierung der PI(3)P-Level durch PI3KC2β als den Mechanismus vorgeschlagen, der der Rettung von XLCNM zugrunde liegt. Allerdings ist der genaue Mechanismus, der dem inversen Zusammenhang zwischen den zellulären Funktionen von MTM1 und PI3KC2β zugrunde liegt, und dessen Relevanz in physiologischen und pathologischen Zuständen der Skelettmuskulatur, nicht vollständig erforscht. Daher war das Ziel dieser Studie, das Zusammenspiel beider Proteine in einem für XLCNM relevanten zellbasierten Kontext mechanistisch weiter aufzuklären, um so die molekulare Grundlage zur Entwicklung von therapeutischen Strategien für XLCNM durch Manipulation von PI3KC2β zu schaffen. Zu diesem Zweck wurde die murine myoblastische Zelllinie C2C12 verwendet, um Knockout (KO)-Zelllinien zu erzeugen, denen MTM1, PI3KC2β oder beide Enzyme fehlen. In diesem System konnten wir beschreiben, dass der Verlust von MTM1 zu defekter Zelladhäsion führt, da Mtm1KO Zellen eine verringerte Zellausbreitung und eine reduzierte Anzahl an FA und oberflächenaktivierten β1-Integrin zeigen, was funktionell mit einer verstärkten Migration und einer beeinträchtigten Muskelzelldifferenzierung verbunden ist. Diese Phänotypen konnten vollständig durch den Co-KO von MTM1 und PI3KC2β umgekehrt werden. Allerdings unterliegt dieser Umkehrung der XLCNM-assoziierten Phänotypen nicht die, wie in der Literatur angenommen, Akkumulation des MTM1-Substrats PI(3)P, da die durch MTM1-Verlust angereicherten PI(3)P Level durch die gleichzeitige Ausschaltung von PI3KC2β nicht reduziert werden konnten. Stattdessen zeigen wir, dass die Inhibition der Endozytose Adhäsionsdefekte in Mtm1KO-Myoblasten verbessern kann. In HeLa-Zellen resultiert der Knockdown (KD) von PI3KC2β in einer beeinträchtigten aktiven β1-Integrin Internalisierung. Mechanistisch wird dies durch eine wichtige Rolle von PI3KC2β bei der Clathrin-vermittelte Endozytose (clathrin-mediated endocytosis; CME) von aktiven β1 Integrinen erklärt. Unsere Ergebnisse unterstützen ein Modell, in dem MTM1 und PI3KC2β antagonistische Rollen bei der Kontrolle aktiver β1-Integrin-Adhäsionen zugewiesen werden, da MTM1 die Integrin Exozytose zur Plasmamembran und PI3KC2β die rückführende Internalisierung der Integrine über CME vermittelt. Weiterhin konnten wir zeigen, dass die Behandlung von Zellen, denen MTM1 fehlt, mit einem neu entwickelten PI3KC2β-Inhibitor die Zelladhäsionsphänotypen umkehren kann und liefern damit die molekulare Grundlage für eine PI3KC2β-gerichtete XLCNM-Therapie. Zusammenfassend geben unsere Ergebnisse Einblicke in Zelladhäsionsdefekte, die für die XLCNM-Pathogenese in einem neu etablierten in vitro-Modellsystem von entscheidender Bedeutung sind. Wir decken außerdem eine neue Funktion von PI3KC2β bei der Regulation von Integrin-Adhäsionen durch CME auf und schaffen einen mechanistischen Hintergrund für die Umkehrung des XLCNM-Krankheitsphänotyps durch PI3KC2β Inhibition, ein wesentlicher Schritt, der den Weg zur Entwicklung von XLCNM-Therapien ebnet.
