Marek’s disease virus genome replication, telomere integration, and live-cell visualization

Abstract

Herpesviruses maintain their genome lifelong in its host by establishing a latent phase of infection. Marek’s disease virus (MDV) is a chicken herpesvirus causing fatal lymphomas and the vaccination against MD is considered to be the first example for vaccination against an agent causing cancer. MDV, as well as some other herpesviruses, achieves latency by incorporating its genome into host telomeres. However, many steps and factors involved in genome integration and reactivation process remain unclear. Our current knowledge about herpesvirus integration is mainly based on results from animal experiments and fluorescence in situ hybridization (FISH). However, FISH cannot be used for a real-time detection of integrated MDV. In this thesis, I established a visualization system utilizing the tetracycline operator/repressor (tetO/TetR) system to optically detect and track MDV genomes without any other additional staining in living cells during different stages of infection. MDV genome consists of two unique regions both flanked by two inverted repeat regions. Genes found in repeat regions are present twice in the genome, several of which are involved in MDV pathogenesis, tumorigenesis, and latency. Therefore, I generated a platform virus lacking the majority of internal repeats (ΔIRLS-HR) to facilitate a straightforward mutation of the virus genome in the repeat region. I demonstrated that such a virus can rapidly restore the deleted repeat region when short terminal sequences are left for homologous recombination. Conversely, viruses unable to restore the internal repeats (ΔIRLS) showed impaired replication and pathogenesis in infected chickens corroborating previous findings in related herpesviruses where deletion of inverted repeat region affected virus pathogenicity. To generate MDV mutants whose genome can be directly detected by microscopy, the tetO sequence was inserted into the ΔIRLS-HR backbone. Fluorescently labeled TetR proteins that specifically bind to tetO sequence were expressed either from cells or from the virus itself. Using this visualization technique, replicating virus genomes, genesis and mobility of viral replication compartments and latent virus were detected. Moreover, these viruses also express another fluorescent protein with a different color for unambiguous identification of infected cells during the lytic stage of virus infection. The combination of both fluorescent proteins revealed not only that MDV can induce syncytia in primary chicken embryo cells, but also that the virus does not replicate in all nuclei of a syncytium. Taken together, ΔIRLS-HR serves as an excellent platform to generate recombinant viruses and in combination with tetO/TetR system we established a powerful tool to visualize virus genomes and to trace the impact of different mutations or gene deletions on the behavior of MDV during lytic replication, latency, and reactivation.

Herpesviren bewahren ihr Genom lebenslang in ihrem Wirt, indem sie während der Infektion eine latente Phase etablieren. Das Alphaherpesvirus der Marek‘schen Krankheit (Marek’s disease virus, MDV) ist ein weitverbreitetes Hühnerherpesvirus, welches tödliche Lymphome verursacht. Die Impfung gegen die Marek‘sche Krankheit gilt als erstes Beispiel für eine Impfung gegen einen Krebserreger. MDV, wie auch einige andere Herpesviren, erreicht seine Latenz, indem es sein Genom in die Wirts-Telomere einbaut. Viele Schritte und Faktoren, die bei der Genomintegration und Reaktivierung eine Rolle spielen, sind jedoch noch ungeklärt. Unser derzeitiges Wissen über die Integration von Herpesviren basiert hauptsächlich auf Ergebnissen aus Tierversuchen und der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH). FISH kann jedoch nicht als Echtzeit-Nachweis eines integrierten MDV verwendet werden. In dieser Arbeit wurde ein Visualisierungssystem unter Verwendung des Tetracyclin-Operator/Repressor-Systems (tetO/TetR) entwickelt. Mit dem System lassen sich MDV-Genome in lebenden Zellen während der verschiedenen Infektionsstadien optisch nachweisen und verfolgen, ohne dass eine zusätzliche Färbung erforderlich ist. Das MDV-Genom besteht aus zwei einzigartigen Regionen, die beide von zwei invertierten Repeat-Regionen umrandet werden. Der Aufbau der Repeat-Regionen ist zweifach ausgeführt. Die Genomgruppe enthält mehrere Gene welche an der Pathogenese, Tumorgenese und Latenz von MDV beteiligt sind. Daher wurde ein Plattformvirus entwickelt, dem der Großteil der internen Repeats fehlt (ΔIRLS-HR), um eine unkomplizierte Mutation des Virusgenoms in der Repeat-Region zu ermöglichen. Es konnte nachgewiesen werden, dass ein solches Virus die gelöschte Repeat-Region schnell wiederherstellen kann, wenn kurze terminale Sequenzen für die homologe Rekombination übrigbleiben. Umgekehrt zeigte ein Virus, das nicht in der Lage war, die internen Repeats wiederherzustellen (ΔIRLS), eine beeinträchtigte Virusreplikation und Pathogenese in infizierten Hühnern. Dies stimmt mit früheren Ergebnissen zu verwandten Herpesviren, bei denen die Deletion der invertierten Repeat-Region die Pathogenität des Virus beeinträchtigte, überein. Um MDV Mutanten zu erzeugen, deren Genome direkt unter dem Mikroskop nachgewiesen werden können, wurde die tetO-Sequenz in das ΔIRLS-HR eingefügt. Fluoreszenzmarkierte TetR-Proteine, die spezifisch an die tetO-Sequenz binden, werden dadurch entweder von Zellen oder von dem Virus eigenständig produziert. Mit dieser Visualisierungstechnik konnten replizierende Virusgenome, die Entstehung und Mobilität von viralen Replikationskompartimenten und latente Viren nachgewiesen werden. Darüber hinaus produzieren diese Viren während des lytischen Infektionsstadiums noch ein weiteres fluoreszierendes Protein von unterschiedlicher Farbe zur eindeutigen Identifizierung der infizierten Zellen. Die Kombination beider fluoreszierender Proteine zeigte nicht nur, dass MDV Synzytien in primären Hühnerembryozellen induzieren kann, sondern auch, dass das Virus nicht in allen Kernen eines Synzytiums repliziert. Alles in Allem dient ΔIRLS-HR als hervorragendes Werkzeug zur Erzeugung rekombinanter Viren, und in Kombination mit dem tetO/TetR-System konnte eine leistungsfähige Herangehensweise zur Visualisierung von Virusgenomen und zur Verfolgung der Auswirkungen verschiedener Mutationen oder Gendeletionen auf das Verhalten von MDV während der lytischen Replikation, Latenz und Reaktivierung geschaffen werden.