Functional characterization of Pseudouridine synthase I and Y-box-binding protein 3

Abstract

Studies of RNA-binding proteins have revealed a large set of factors that assemble into ribonucleoprotein particles and regulate each step of the mRNA life cycle from transcription to translation and decay. In these processes, mRNA editing is considered an important step. Amongst different RNA editing enzymes, pseudouridine synthase 1 (PUS1) is a member of the RNA-independent pseudouridine synthase family and has been detected in the mRNA-bound proteome studies in human and yeast. PUS1 function had been previously associated with tRNA modification and translation efficiency. However, pseudouridylation has not been understood in the context of regulation of stability, translation or degradation of mRNA. In this thesis, I have applied PAR-CLIP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) in combination with next-generation sequencing in order to identify PUS1 RNA binding sites across the transcriptome. We discovered that PUS1 has a high binding preference towards coding sequence regions of mRNA. Furthermore, we validated two known biologically relevant PUS1 pseudouridine sites in tRNALys (UUU) using an N-Cyclohexyl-N’-(2-morpholinoethyl)carbodiimide methyl-ptoluensulfonate (CMCT)-treatment in combination with primer extension. We applied the same method to identify individual pseudouridine sites in PUS1-bound transcripts and detected a reverse transcriptase stop in the last exon of CCT3 mRNA. The Y-box binding protein 3 is one of the RNA-binding proteins with multiple functions bearing a highly conserved cold shock domain involved in nucleic acid binding. The multifunctional roles of YBX3 have been correlated with transcription and translation, however, the molecular mechanism of post- transcriptional regulation has not been uncovered. Using PAR-CLIP we found thousands of YBX3 binding sites in a large number of mRNA target transcripts. YBX3 binding pattern revealed an equal preference towards 3’ UTRs and CDSs. We analyzed YBX3 RNA sequence preferences and identified a consensus motif among the top target transcripts. To asses the influence of YBX3 on protein synthesis, we applied a pSILAC (pulsed Stable Isoptope Labeling with Amino Acids in Cell Culture) based quantitative proteomics. We found that translation of YBX3 top mRNA targets is increased upon YBX3 depletion. In addition, proteins from top bound transcripts, containing the YBX3 consensus motif in their 3’ UTR, were significantly more abundant upon YBX3 depletion, suggesting that YBX3 could have a potential role in translational repression or mRNA stability. The 3’ UTRs of several candidates were validated using a dual luciferase reporter assay combined with YBX3 knockdown. We investigated YBX3 function in a protein-protein interaction assay using SILAC and mass- spectrometry and found that YBX3 interacts with other RNA-binding proteins and several translation initiation factors, suggesting a potential role in translational regulation. In summary, the study of two different RNA-binding proteins and their associated mRNA target transcripts indicated that both PUS1 and YBX3 might play important functional roles in post-transcriptional regulation. A further investigation could provide insights at which stage these proteins are indispensable and influence in a global manner mRNA stability or translation.

Bisherige Studie über RNA-bindende Proteine haben eine große Anzahl von Faktoren beschrieben, die in Ribonukleoprotein-Komplexe jeden Schritt im Leben einer Boten- RNA (mRNA) regulieren, von der Transkription hin zu Translation und Abbau. Das Editieren von RNA, d.h. die Veränderung einzelner Nukleotide nach der Transkription, ist dabei ein wichtiger Schritt. Neben anderen Enzyme spielt dabei die Pseudouridin- Synthase 1 (PUS1), die in Hefe und menschlichen Zellen gefunden wurde, eine Rolle. PUS1 wurde bisher mit der Editierung von Transfer-RNA und der Regulierung der Translationseffizienz assoziiert. Über die Funktion von PUS1 in der Regulierung der Stabilität von mRNA sowie deren Translation ist bisher nichts bekannt. In dieser Doktorarbeit verwendete ich PAR-CLIP (Photoactivierbares-Ribonucleosid- Gestütztes Crosslinking und Immunoprecipitation) in Kombination mit Hochdurchsatzsequenzierung, um die Bindungsstelle von PUS1 im Transkriptom zu identifizieren. Dies hat gezeigt, das PUS1 vor allem im kodierenden Teil der mRNA bindet. Zudem konnten wir, mittels N-Cyclohexyl-N’-(2-morpholinoethyl)carbodiimide methyl-p-toluensulfonate (CMCT)-Behandlung kombiniert mit reverser Transkription, zwei physiologisch relevante PUS1-abhängige Pseudouridine in tRNALys(UUU) validieren. Dieselbe Methode haben wir darauf für die Identifizierung einzelner Pseudouridine in von PUS1 gebundenden Transkripten verwendet, und eine mögliche solche Modifikation im letzten Exon der CCT3-mRNA gefunden. Ein anderes RNA-bindendes Protein ist das Y-Box bindende Protein 3 (YBX3). YBX3 hat verschiedene Funktionen und besitzt eine evolutionär hoch konservierte Kälteschock-Domäne. YBX3 ist involviert in Transkription und Translation von mRNA, die molekularen Mechanismen sind aber noch unbekannt. Mittels PAR-CLIP konnten wir tausende Bindungsstellen im Transkriptom identifizieren, gleichermaßen im kodierenden Teil und den untranslatierten Regionen am 3'-Ende der mRNAs (3'-UTRs). Die Analyse der gebundenen Sequenzen zeigte ein definiertes Sequenz-Motiv, das von YBX3 erkannt wird. Um den Einfluss von YBX3 auf die Proteinmenge zu bestimmen, haben wir pSILAC (pulsed Stable Isoptope Labeling with Amino Acids in Cell Culture) angewandt. Bei dieser auf Massenspektrometrie beruhenden Methoden werden mit schweren Isotopen markierte Aminosäuren eingesetzt, um Änderungen der Proteinmengen quantifizieren zu können. In diesem Experiment haben wir beobachtet, dass die Depletierung von YBX3 die Mengen der Proteine, die von den von YBX3 gebundenen mRNAs translatiert wird, erhöht. Insgesamt waren die Proteine, deren mRNAs das YBX3- Sequenzmotiv in ihren 3'-UTRs beinhalten, erhöht. Dies deutet darauf hin, dass YBX3 einen negativen Einfluss auf Translation und/oder mRNA- Stabilität hat. Validiert wurde dies mittels Luciferase-Reporter-Experimenten kombiniert mit YBX3-Depletierung. In Proteinbindungsexperimenten zeigte sich, dass YBX3 indirekt mit anderen RNAbindenden Proteinen und Translationsinitiationsfaktoren interagiert. Zusammengefasst haben unsere Experimente dargelegt, dass PUS1 und YBX3 wichtige Funktionen in der post- transkriptionellen Regulation aufweisen. Weitere Studien können nun eingrenzen, wie diese Proteine auf globale Art und Weise in die Translation und mRNA-Stabilität eingreifen.