The family Felidae includes 38 non-domestic species and the domestic cat (Felis catus). Twenty-four of the non-domestic species are listed in the Red List of the IUCN as near-threatened or threatened. In order to counteract species extinction and further loss of genetic diversity, breeding programs and effective application of assisted reproductive technologies (ARTs) are poised to make a substantial contribution to ensure that they will not go extinct. Important ARTs used in ex situ breeding programs are sperm cryo-preservation and artificial insemination (AI). It is possible to obtain offspring from a single artificial insemination in felids, but the success of fertilization depends, among other things, strongly on the type of sperm. Both epididymal and ejaculate sperm are cryo-preserved in banks for future AI and further ARTs. Ejaculate sperm have a higher degree of maturity and contact with seminal plasma and therefore a better fertilization competence than epididymal sperm. Fertilization success is also higher when fresh and not cryo-preserved sperm are used for AI and for in vitro fertilization. Depending on the method of AI (intra-vaginal, trans-cervical, intra-uterine, intra-tubal) the sperm has to overcome different barriers to reach the oviduct. A functional sperm reservoir is formed in the isthmus of the oviduct during the period when the oocytes mature; they are fertilized in the isthmusampulla junction. Early embryo development also takes place in the oviduct. Especially the sperm storage in the isthmus, where the final sperm maturation, capacitation, occurs, is decisive for sperm to obtain fertilization competence and to prevent polyspermy. However, it is unknown whether the lower proportions of successful fertilization following AI using epididymal and / or cryo-preserved sperm in felids are due to the fact that the sperm reservoir cannot be formed because epididymal sperm lack contact with seminal plasma (SP) proteins that mediate sperm-oviduct binding or the sperm membrane is damaged by the freezing process and can therefore no longer bind to the oviduct epithelial cells (OEC). We therefore investigated two important aspects which may play a role in the interaction between sperm and oviduct. Using the domestic cat as model species, we wanted to develop suggestions to optimize preservation and insemination protocols to improve the efficiency of ARTs in endangered felid species. First, we investigated the influence of the seminal plasma on sperm-oviduct binding (chapter I, also called SP-study) and aimed to find out whether (1) the SP has an influence on epididymal sperm quality, (2) epididymal sperm are able to bind to oviduct epithelial cells in vitro, and (3) whether the SP has an influence on in vitro binding efficiency. Epididymal spermatozoa (with or without SP) were coincubated with freshly isolated feline OEC (FOEC) so-called explants. The SP-study revealed that epididymal spermatozoa of the domestic cat are able to bind to FOEC-explants and that the SP plays a supporting role in the sperm binding process. In the second study (chapter II, also referred to as equilibration-study) we examine whether the contact of sperm to the freezing extender and cooling to 15°C during equilibration might change sperm-oviduct binding patterns in quantity and quality (bound by sperm head or tail, sperm with active or inactive mitochondria). Epididymal sperm (with or without equilibration) were co-incubated with isolated FOEC-vesicles. FOEC-vesicles formed from FOEC-explants during the short-term suspension culture. The use of the vesicles had the advantage that they survived longer and retained their sperm binding capacity longer than explants. The equilibration-study showed that the binding capacity of epididymal sperm to FOEC-vesicles was reduced when sperm were diluted in freezing extender and equilibrated to 15°C. We suggest that the main sperm population bound by head to FOEC-vesicles and possessing 4active mitochondria is the competent sperm population that would be primed and subsequently released for fertilization in vivo. Explants and vesicles which were used in the first and second study, respectively, have the disadvantage that their viability and differentiation state is limited to a short time. The polarized-monolayer culture of OEC in a compartmentalized system is well characterized and established in laboratory mouse, domestic pig, domestic cattle and human OEC where OEC have a phenotype similar to in vivo tissue and are well differentiated. In the third study (chapter III) we took the first steps to establish a polarized monolayer long-term culture of FOEC of the domestic cat to establish a reproducible in vitro model for use in basic reproductive research and assisted reproduction. The experiments of the third study showed that the long-term culture of FOEC in a compartmentalized culture system is possible in principle. However, the desired result – a differentiated, monolayered, highly prismatic epithelium with secretory as well as ciliated cells – could not yet be reliably (and reproducibly) achieved. In future studies, progenitor cells should be identified and isolated from the epithelium of the feline oviduct in order to use them as starting material for culture. With this work, we have shown for the first time that a highly differentiated monolayer culture of FOEC in a compartmentalized system is possible in principle. In addition, we also elucidated two important aspects of sperm-oviduct interaction that may help to optimize protocols for sperm cryo-preservation and sperm handling prior to artificial insemination.
Die Familie der Katzen (Felidae) umfasst 38 nicht-domestizierte Arten und die Hauskatze (Felis catus). Vierundzwanzig der nicht-domestizierten Arten sind in der Roten Liste der IUCN als nahezu bedroht oder gefährdet aufgeführt. Um dem Aussterben der Arten und dem weiteren Verlust der genetischen Vielfalt entgegenzuwirken, leisten Zuchtprogramme und die wirksame Anwendung von assistierten Reproduktionstechnologien (ART) einen wichtigen Beitrag. Wichtige ART, die in ex-situZuchtprogrammen eingesetzt werden, sind die kryo-Konservierung von Spermien und die künstliche Besamung (KB). Es ist möglich in Feliden Nachkommen aus einer einmaligen künstlichen Besamung zu erhalten, jedoch sind die Fertilisationserfolge u.a. stark von der Art der Spermien abhängig. Sowohl epididymale als auch ejakulierte Spermien werden kryo-konserviert. Aufgrund des höheren Reifegrads und des Kontakts mit dem Seminalplasma (SP) haben Ejakulatspermien eine bessere Befruchtungskompetenz als Nebenhodenspermien. Außerdem werden bessere Befruchtungserfolge erzielt, wenn frische im Vergleich zu kryo-konservierten Spermien für die In-vitro-Fertilisation sowie für die KB verwendet werden. Je nach Methode der KB (intra-vaginal, trans-zervikal, intra-uterin, intratubal) müssen die Spermien unterschiedliche Barrieren überwinden, um den Eileiter zu erreichen. Im Isthmus des Eileiters wird ein Spermienreservoir gebildet, die Eizellen werden in der Ampulla bzw. im Übergang vom Isthmus zur Ampulla befruchtet. Auch die frühe Embryonalentwicklung findet im Eileiter statt. Insbesondere die Spermienlagerung im Isthmus ist entscheidend für die Erlangung der Befruchtungskompetenz der Spermien. Es ist jedoch nicht bekannt, ob die niedrigeren Befruchtungsratennach KB mit Nebenhodenspermien bei Feliden darauf zurückzuführen sind, dass das Spermienreservoir nicht gebildet werden kann, weil den epididymalen Spermien der Kontakt mit den Seminalplasma-Proteinen fehlt, die die Bindung zwischen Spermien und Eileiter vermitteln, und/oder ob die Spermien durch den Gefrierprozess geschädigt sind und daher nicht mehr an die Epithelzellen des Eileiters binden können. Daher haben wir zwei wichtige Aspekte untersucht, die bei der Interaktion zwischen Spermien und Eileiter eine Rolle spielen könnten. Mit der Hauskatze als Modellspezies wollen wir zur Optimierung von Konservierungs- und Besamungsprotokollen beitragen, um die Effizienz von ART bei gefährdeten Katzenarten zu verbessern. Zunächst untersuchten wir den Einfluss von SP (Kapitel I) und wollten herausfinden, ob (1) SP einen Einfluss auf die epididymale Spermienqualität hat, (2) epididymale Spermien in der Lage sind, in vitro an Epithelzellen des Eileiters (feline oviduct epithelial cells, FOEC) zu binden, und (3) ob SP einen Einfluss auf die in vitro-Bindungskapazität hat. Epididymale Spermien (mit oder ohne SP) wurden mit frisch isolierten FOEC, sogenannten Explants (Kapitel I), co-inkubiert. Die SP-Studie ergab, dass epididymale Spermien der Hauskatze in der Lage sind, an FOEC-Explants zu binden und dass SP darüber hinaus eine unterstützende Rolle bei der Spermienbindung spielt. In der zweiten Studie (Kapitel II) wurde untersucht, ob der Kontakt der Spermien mit einem GefrierExtender und die Abkühlung auf 15°C während der Equilibrierung die Spermien-OviduktBindungsmuster in Quantität und Qualität (Bindung mit Spermienkopf oder Schwanz, Spermien mit aktiven oder inaktiven Mitochondrien) verändern. Dazu wurden epididymale Spermien (mit oder ohne Equilibrierung) mit FOEC-Vesikeln co-inkubiert. Die FOEC-Vesikel formierten sich während kurzzeitiger Suspensionskultur aus FOEC-Explants. Die Verwendung der Vesikel hatte den Vorteil, dass sie länger überlebten und länger ihre Bindungskapazität für Spermien behielten als Explants. Die Equilibrierungsstudie zeigte, dass die Bindungskapazität von epididymalen Spermien an FOEC-Vesikel reduziert war, wenn die Spermien in Gefrier-Extender verdünnt und auf 15°C equilibriert wurden. Wir 6vermuten, dass die Hauptpopulation der Spermien, die mit dem Kopf an die FOEC-Vesikel binden und aktive Mitochondrien besitzen, die Spermienpopulation ist, die Befruchtungskompetenz besitzt. Explants und Vesikel, die in der ersten bzw. zweiten Studie verwendet wurden, haben den Nachteil, dass ihre Lebensfähigkeit und ihr Differenzierungszustand auf kurze Zeit begrenzt sind. Eine polarisierte Monolayerkultur von OEC, kultiviert in einem kompartimentierten System, ist von Mäusen, Schweinen, Rindern und Menschen gut charakterisiert und etabliert. Die Kulturen ähneln im Phänotyp dem in vivo-Gewebe und sind gut differenziert. In der dritten Studie (Kapitel III) haben wir erste Schritte zur Etablierung einer polarisierte-Monolayer-Langzeitkultur von felinen OEC der Hauskatze unternommen, um ein reproduzierbares in-vitro-Modell für den Einsatz in der Grundlagenforschung der Reproduktionsbiologie und der assistierten Reproduktion zu schaffen. Die Experimente der dritten Studie haben gezeigt, dass eine Langzeitkultur von FOEC in einem kompartimentierten Kultursystem prinzipiell möglich ist. Das gewünschte Ergebnis - ein differenziertes, einschichtiges, hochprismatisches Epithel mit sekretorischen sowie Zilien-tragenden Zellen - konnte jedoch noch nicht reproduzierbar erreicht werden. In zukünftigen Studien sollten Progenitorzellen aus dem Epithel des felinen Eileiters identifiziert und isoliert werden, um sie als definiertes Ausgangsmaterial für die Kultur zu verwenden. Mit dieser Arbeit haben wir zum ersten Mal gezeigt, dass eine hochdifferenzierte epitheliale Eileiter - Zellkultur bei der Hauskatze prinzipiell möglich ist. Außerdem haben wir zwei wichtige Aspekte der Spermien-Eileiter-Interaktion aufgeklärt, die dabei helfen können, Protokolle für die kryoKonservierung von Spermien sowie das Spermien-Handling vor der künstlichen Besamung zu optimieren.
