NeuroD family transcription factors regulate corpus callosum formation and cell differentiation during cerebral cortical development

Abstract

Corpus callosum formation is severely defective in NeuroD2/6 double deficient (DKO) mice. Callosal axons defasciculate and stall prior to the midline interaction, or grow astray away from the subventricular zone (SVZ) into ipsilateral cortical plate. Here, I have shown that restoration of either NeuroD2 or NeuroD6 expression by in utero electroporation in NeuroD2/6 DKO mice enables callosal fibers to maintain fasciculation across the midline, indicating that these transcription factors regulate long-range axonal projection cell intrinsically. Many potential NeuroD2/6 downstream targets are identified by an expression scanning, including transcription factors, axonal adhesion and guidance molecules. For the promising candidates, I have performed in vivo gain-of-function experiments and analyzed downstream signaling pathways. The genetic deletion of NeuroD2/6 has little effect on determination of callosal projection neuron fate or cortical layer organization. However, NeuroD2/6 modulate callosal axon guidance cues, especially Eph-ephrin signaling. A number of genes involved in Eph-ephrin signaling display altered expression patterns, including Ephrin-A4 ligand (EfnA4). EfnA4, which normally follows high laterally - low medially expression gradient in upper layer neurons, acts downstream of NeuroD2/6 to promote callosal axogenesis. This finding is supported by the observation that EfnA4 electroporation into NeuroD2/6 DKO embryos facilitates the fasciculation of callosal axons and steers outgrown axons towards the midline. Neither secreted EfnA4 (glycosylphosphatidylinositol-attachment signal replaced by flag tag) nor mutated EfnA4 variant (no interaction with EphA receptors) is able to rescue corpus callosum agenesis in DKO embryos. Notably, restoration of ephrin receptors or other ligands fails to rescue the acallosal phenotypes, suggesting that EfnA4 functions in a specific manner. EfnA4 and Ntrk2 (TrkB) are both expressed in developing neocortex and can be co-immunoprecipitated with each other in vitro. Co-electroporation of EfnA4 with kinase-dead Ntrk2, but not kinase-dead Ntrk3, prevents EfnA4 mediated rescue, implicating that Ntrk2 might be a cis-interacting co-receptor for EfnA4 reverse signaling. The EfnA4-Ntrk2 interplay modulates intracellular phospho-AKT signaling in vitro and in vivo. Furthermore, mutation of the Ntrk2’s SHC binding site (Y515F), but not the PLCγ1 binding site (Y816F), specifically interferes with EfnA4 promoted callosal axon growth. Considering the expression patterns of EphA receptors and their interaction with EfnA4-Ntrk2 complexes in trans, I propose a model that the expression of Eph receptors in the medial neocortex and ventricular zone creates a permissive channel for callosal axons carrying EfnA4-Ntrk2 complexes in the SVZ. I also find that NeuroD2/6 may intrinsically and extrinsically regulate the differentiation of Tbr2+ and Olig2+ progenitors, respectively.

Die Entstehung des Corpus Callosum ist in NeuroD2/6 defizienten Mäusen massiv gestört. Die Axone callosaler Neurone defaszikulieren vor Erreichen der Mittellinie. Gezieltes callosales Wachstum findet nicht statt und viele Axone wachsten stattdessen ungezielt in die ipsilaterale Kortikalplatte. Ich zeige hier, dass die experimentelle Wiederherstellung der NeuroD2- oder NeuroD6-Expression durch In-Utero Elektroporation in NeuroD2/6 defizienten Embryonen ausreicht, um das gezielte und faszikulierte Wachstum callosaler Neuronen bis zum erreichen des kontralateralen Kortex sicher zu stellen. NeuroD2/6 regulieren also das callosale Axonwachstum auf zellintrinsische Weise. Weiterhin identifiziere ich mit Hilfe einer Expressionsanalyse eine Reihe potentieller Effektorgene von NeuroD2/6, darunter Transkriptionsfaktoren und axonale Adhäsions- und Lenkungsmoleküle. Die wichtigsten Kandidaten untersuche ich auch funktionell über Gain-of-Function Experimente und die Analyse der nachfolgenden Signalwege. Im Rahmen des Projekts zeige ich, dass die Deletion von NeuroD2/6 wenig Einfluß auf die Determination von callosalen Projektionsneuronen und die Organisation der Kortikalen Schichtung hat. Trotzdem modulieren die beiden Transkriptionsfaktoten das Wachstum callosaler Axone und insbesondere den Eph-ephrin Signalweg. Eine Reihe von Genen die in Beziehung zu diesem Signalweg stehen zeigen veränderte Expressionsmuster. Ich zeige, dass Ephrin-A4 (EfnA4), dessen Expression in den Neuronen der oberen Schichten des Neokortex normalerweise einem latero-medial orientieren Gradienten folgt, unter der Kontrolle von NeuroD2/6 steht und das callosale Axonwachtum beeinflusst. Die Elektroporation von EfnA4 in den Neocortex von NeuroD2/6 defizienten Embryonen führt ebenfalls zur Wiederherstellung der Faszikulation und des gezielten Wachstums callosaler Axone Richtung Mittellinie. Weder eine sekretiere Form von EfnA4 (der GPI-Anker wurde durch ein Flag Tag ersetzt) noch eine mutierte Variante die nicht mehr in der Lage ist, Eph-Rezeptoren zu binden, führen zu einer vergleichbaren Wiederherstellung der callosalen Axogenese in NeuroD2/6 defizienten Mäusen. Da auch die Elektroporation von Eph-Rezeptoren oder anderen Ephrinen zu keinem vergleichbaren Effekt führt, kann davon ausgegangen werden, dass die Funktion von Efna4 bei der Entstehung des Corpus Callosum spezifisch ist. Sowohl EfnA4 also auch Ntrk2/3 werden im sich entwickelnden Neokortex exprimiert und können in-vitro miteinander co-immunoprezipitiert werden. Die Co-elektroporation von EfnA4 mit einer dominant negativen (kinase-dead) Variante von Ntrk2 (aber nicht von Ntrk3) in NeuroD2/6 deficienten embryonen verhindert die Wiederherstellung der callosalen Axogenese. Die impliziert, dass Ntrk2 ein cis-interagierender Co-Rezeptor für den reverse EfnA4 Signalweg seien könnte. Das Zusammenspiel von EfnA4 und Ntrk2 moduliert intrazellular den PI3K-Akt Sinalweg in vitro und in vivo. Weiterhin zeige ich, dass die Mutation der Shc Bindedomäne (aber nicht der PLCγ1 Bindedomände) von Ntrk2 mit der Wiederherstellung des callosalen Axonwachtums in NeuroD2/6 defizienten Embryonen interferiert. Unter Berücksichtigung der Expressionsmuster von Eph- Rezeptoren in der medialen Kortikalplatte und Ventrikularzone und der Interaktion von Eph-Rezeptoren mit EfnA4-Ntrk2 Komplexen in trans, schlage ich als Modell vor, dass die trans-Interaktion von Eph-Rezeptoren mit EfnA4-Ntrk2 Komplexen zur Axonalen Repulsion führt und dass die Abwesenheit von Eph- Rezeptoren in der Intermediärzone des medialen Kortex einen permissiven Kanal für die Entstehung des Corpus Callosum bildet. In weiteren Experimenten konnte ich zeigen, dass NeuroD2/6 auf zell-intrinsische und zell-extrinsische Weise die Differenzierung von Tbr2-positiven und Olig2-positiven Vorläuferzellen beeinflussen können. Die zugrundelegenden Mechanismen müssen allerdings noch identifiziert werden.