dc.contributor.author
Zhao, Hongfan
dc.date.accessioned
2023-03-03T13:21:51Z
dc.date.available
2023-03-03T13:21:51Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/36569
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-36282
dc.description.abstract
Protease-activated receptor 2 (PAR2) is broadly expressed on endothelial cells
contributing to inflammatory processes and angiogenesis. Autoantibodies against
PAR2 can regulate these functions in health and disease. Recently, a collaboration
group discovered in a prospective observational cohort study that stroke patients with
a higher concentration (highest quartile Q4) of PAR2-IgG presented a poor clinical
outcome compared to others (lower quartiles Q1-3). However, the biological
functions and molecular mechanism remain unclear. Therefore this study aims to
explore the possible function of PAR2-IgG on endothelial-based angiogenesis which
might have an essential impact on clinical outcome after stroke. Methods:
IgGs were isolated from the sera of stroke patients (Q1-3 and Q4), then Matrigel
angiogenesis assay was used to study vascular tube formation by IgGs and the natural
PAR2 agonist trypsin in vascular endothelial cells (HMEC-1 and hCMEC/D3, a
blood-brain barrier human endothelial cell line). Additionally, qRT-PCR, western blot, and ELISA were used to investigate the angiogenic signaling pathways. The
activation of G-protein subunits was examined by the Luciferase reporter assay, based
on mutations of wild-type PAR2 and extracellular loops (ECLs). The receptor
internalization was studied by Nano-Glo
®HiBiT detection assay. The main inductor of
angiogenesis VEGF was examined in detail by promoter assay with regard to the
activation of the promoter and potential binding fragments of transcription factors. Results:
The PAR2 agonist trypsin was involved in the regulation of mRNA synthesis and
protein release of VEGF, IL-6, IL-8, CXCL1 and ANG2 through the ERK1/2
signaling pathway, which promoted vascular tube formation of HMEC-1. Q1-3
PAR2-IgG enhanced angiogenesis via PAR2-ERK1/2-induced angiogenic cytokines
and receptor internalization when compared to Q4 PAR2-IgG. Q1-3 PAR2-IgG
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triggered Gq/11 activation -, but not G12/13 -, and the mutation of ECL1-3 did not alter
the activation. As for Q4, the ECL3 mutation increased the Gq/11 activation and
ERK1/2 activation. Different truncations of the VEGF promoter assay confirmed the
binding sites of transcription factors located in the VEGF promoter sequence -1339 to
-839 bp, and the inhibition of AP-1 completely blocked the promoter activation. To
summarize, in contrast to the Q4 group, Q1-3 PAR2-IgG induced greater receptor
internalization, Gq/11 activation, ERK1/2 activation, and angiogenic gene production, which resulted in increased formation of vascular tubes. Conclusion:
The present work elucidated new PAR2 signaling pathways that are induced by
PAR2-IgG in human endothelial cells and identified contrary functional consequences
on the angiogenesis of PAR2-IgGs from two different stroke patient cohorts classified
by different PAR2-IgG titer ranges. Novel therapeutics modulating PAR2-IgGs in
stroke patients might thereby already limit stroke progression at an early stage and
lead to improved clinical outcome.
en
dc.description.abstract
Hintergrund:
Protease-aktivierter Rezeptor 2 (PAR2) ist auf Endothelzellen hoch exprimiert und
reguliert inflammatorische Prozesse und Angiogenese. Autoantikörper gegen PAR2
können diese Funktionen physiologisch und pathophysiologisch beeinflussen. Vor
kurzem entdeckten Kollaborationspartner in einer prospektiven Kohortenstudie, dass
Schlaganfallpatienten mit hohen PAR2-Spiegeln (höchstes Quartil Q4) einen
schlechteren klinischen Outcome hatten als Patienten mit niedrigeren Spiegeln
(Quartile Q1-3). Die molekularen Mechanismen dafür waren allerdings ungeklärt. Es
war daher das Ziel dieser Studie, eine mögliche Bedeutung dieser PAR2-IgGs auf
endotheliale Angiogenese zu untersuchen, die sich positiv auf den klinischen
Outcome auswirken könnten. Methoden:
IgGs wurden von Schlaganfallpatienten (Q1-3 und Q4) isoliert und dann der Matrigel
Angiogenese Assay benutzt, um Gefäßbildungen von Endothelzellen (HMEC-1 und
hCMEC/D3, einer humanen Bluthirnschranken-Endothelzelllinie) durch die IgGs und
den natürlichen Agonisten von PAR2, Trypsin, zu untersuchen. Weiterhin dienten
qRT-PCR, Westernblots und ELISA zur Erforschung angiogenetischer Signalwege. Luziferase-Reporter-Assays wurden durchgeführt, um die Aktivierung von
G-Protein-Untereinheiten mithilfe von Mutationen von Wildtyp-PAR2 und der
extrazellulären Schleifen (ECLs) zu untersuchen. Die Internalisierung des Rezeptors
wurde visualisiert mit dem Nano-Glo
®HiBiT Detektionsassay. Der Hauptaktivator der
Angiogenese, VEGF, wurde detailliert untersucht mithilfe von
Promotoraktivierungsstudien und Bindungsfragmente. Ergebnisse:
Der PAR2 Agonist Trypsin beeinflusste die mRNA Synthese und Proteinfreisetzung
von VEGF, IL-6, IL-8, CXCL1 und ANG2 über den ERK1/2 Signalweg und förderte
die Ausbildung vaskulärer Gefäßschläuche in HMEC-1. Im Vergleich zu Q4
PAR2-IgG erhöhte Q1-3 PAR2-IgG Angiogenese durch Freisetzung von
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angiogentischer Zytokine über PAR2-ERK1/2-Aktivierung und
Rezeptorinternalisierung. Q1-3 PAR2-IgG triggerte die Aktivierung von Gq/11, aber
nicht von G12/13, und Mutationen von ECL1-3 hatten keinen Einfluss auf die
Aktivierung. VEGF Promotorassays bestätigten die Bindungsstelle des
Transkriptionsfaktors AP-1 an der VEGF-Promotorsequenz -1339 bis -839 bp. Zusammenfassend induzierte Q1-3 PAR2-IgG im Gegensatz zu Q4 PAR2-IgG eine
verstärkte Rezeptorinternalisierung, Gq/11 – und ERK1/2-Aktivierung und Induktion
angiogenetischer Gene, was in einer verstärkten Netzwerkbildung resultierte. Schlussfolgerung:
Die hier dargestellte Arbeit beschreibt neue Signalwege von PAR2 in humanen
Endothelzellen, die durch PAR2-IgG aktiviert werden und identifizierte
gegensätzliche Auswirkungen auf Angiogenese durch PAR2-IgG von zwei
unterschiedlichen Schlaganfallkohorten mit besonders hohen (Q4) oder
niedrig-mäßigen (Q1-3) PAR2-IgG-Spiegeln. Die Modulation von PAR2-IgGs könnte
eine neue Therapieform bei Schlaganfall darstellen, um die Progression im Verlauf zu
verhindern und zu verbessertem klinischem Outcome zu führen.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
autoantibodies
en
dc.subject
endothelial-based angiogenesis
en
dc.subject
inflammation
en
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Schlaganfall abhängige Mechanismen der endothelialen autoimmunen PAR2 Aktivierung
dc.contributor.gender
male
dc.contributor.firstReferee
N.N.
dc.contributor.furtherReferee
N.N.
dc.date.accepted
2023-03-03
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-refubium-36569-0
dc.title.translated
Stroke dependent mechanisms of endothelial autoimmune PAR2 activation
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access