Illuminating the function of AMPA receptors with fluorescent probes

Abstract

The family of ionotropic glutamate receptors (iGluRs) mediates the majority of fast excitatory synaptic transmission in the central nervous system. Their implication in higher brain function and life-threatening neurological disorders makes this protein family the target of numerous investigations. Despite immense progress in unraveling the structure and function of iGluRs, central questions remain unanswered. What conformational changes accompany and enable the sub- millisecond activation rates of the receptors? Which sites of the receptor are central for function and regulation? Although structural details are available for all iGluR subtypes through crystallographic and electron microscopy studies, little evidence exists to support the theories of the dynamic structural rearrangements within the receptor during the gating cycle. Furthermore, as the intracellular C-terminal tail and loops are unresolved in all structures available to date, structural and dynamic information about this region of the receptor is limited. In the present study AMPA receptor subunits were labelled with variants of green fluorescent protein (GFP) through genetic incorporation into various insertion sites in both the extracellular and the intracellular regions of the receptor. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) signals between these strategically positioned fluorophores were combined with simultaneous electrophysiological measurements to record conformational rearrangements during receptor gating in real time. On the level of the intracellular domains, insertion of yellow and cyan fluorescent proteins (YFP and CFP, respectively) in the loop connecting the M1 and M2 transmembrane helices and the C- terminal tail enabled us to measure conformational rearrangements in response to an extracellularly- binding allosteric modulator cyclothiazide (CTZ), which blocks receptor desensitisation. Following the lead of the conformational changes of this region, FRET between single YFP insertions in the two intracellular positions and a membrane bound quencher showed state- dependent changes during receptor gating, and allowed us to map the positions of the insertion sites relative to the membrane in the receptor resting, desensitised and active states. Fluorescent insertions within the extracellular domains of the AMPA receptor allowed us to probe both lateral and orthogonal movements of the ligand binding and amino terminal domains. Additionally, genetically labelling a transmembrane AMPA receptor regulatory protein (TARP) with an acceptor fluorophore enabled direct visualisation of complex association and dynamics, which could be functionally confirmed through simultaneous electrophysiological recordings. In summary, these experiments gave – for the first time – a concurrent visualisation of structure- function correlation of AMPA receptors, and could ultimately lead to optically active glutamate receptors capable of reporting their own activity.

Die Familie von ionotropen Glutamatrezeptoren (iGluRs) vermittelt die Mehrzahl der schnellen exzitatorischen synaptischen Transmission im Zentralnervensystem. Ihre Verwicklung in höheren Gehirnfunktion und lebensbedrohlichen neurologischen Störungen macht diese Proteinfamilie das Ziel zahlreicher Untersuchungen. Trotz immensen Fortschritte in der Struktur und Funktion von iGluRs entwirren, zentrale Fragen bleiben unbeantwortet. Welche Konformationsänderungen begleiten und ermöglichen die Untermillisekunde Aktivierungsraten der Rezeptoren? Welche Websites des Rezeptors sind für Funktion und Regulation zentraler? Obwohl strukturelle Details für alle iGluR Subtypen durch kristallographische und Elektronenmikroskopie-Studien verfügbar sind, gibt es wenig Beweise für die Theorien der dynamischen Strukturänderungen innerhalb des Rezeptors während des Gating-Zyklus zu unterstützen. Ferner ist, wie die intrazelluläre C-terminale Schwanz und Schleifen in allen Strukturen verfügbar bisher ungelöst sind, strukturelle und dynamische Informationen über diese Region des Rezeptors ist begrenzt. In der vorliegenden Studie AMPA-Rezeptor-Untereinheiten wurden mit Varianten des Green Fluorescent Protein (GFP), durch genetische Einarbeitung in unterschiedliche Insertionsstellen markierten sowohl in der extrazellulären und intrazellulären Regionen des Rezeptors. Fluoreszenz- Resonanz-Energie- Transfer (FRET) Signale zwischen diesen strategisch positionierte Fluorophore wurden bei gleichzeitiger elektrophysiologischen Messungen kombiniert, um Konformationsänderungen während Rezeptor-Gating in Echtzeit aufnehmen. Auf der Ebene der intrazellulären Domänen, Insertion von Gelb und Cyan fluoreszierende Proteine (YFP und CFP sind) in der Schleife, die M1 und M2 Transmembran- Helices und den C-terminalen Schwanz verbindet es uns ermöglicht, Konformationsänderungen in Reaktion auf eine extracellularly- zu messen Bindung allosterischer Modulator Cyclothiazid (CTZ), die Blöcke Rezeptor Desensibilisierung. Nach dem Vorbild der Konformationsänderungen dieser Region, FRET zwischen einzelnen YFP Einfügungen in den beiden intrazellulären Positionen und eine Membran gebundenen Quencher zeigte zustandsabhängigen Veränderungen während der Rezeptor- Gating und erlaubt es uns, die Positionen der Insertionsstellen in Bezug auf die Membran zu kartieren in dem Rezeptor ruhende, desensibilisiert und aktive Zustände. Fluorescent Einfügungen innerhalb der extrazellulären Domänen des Rezeptors AMPA erlaubt uns sowohl lateral als auch orthogonale Bewegungen der Ligandenbindung und aminoterminalen Domänen zu untersuchen. Zusätzlich Kennzeichnung genetisch ein Trans AMPA-Rezeptor- Regulatorprotein (TARP) mit einem Akzeptor-Fluorophor direkte Visualisierung komplexer Assoziation und Dynamik ermöglicht, die funktionell durch gleichzeitige elektrophysiologischen Ableitungen bestätigt werden konnte. Zusammenfassend ergaben diese Experimente - zum ersten Mal - eine gleichzeitige Visualisierung von Struktur-Funktions-Beziehung von AMPA- Rezeptoren und letztendlich zu optisch aktiven Glutamat-Rezeptoren fähig berichten ihre eigene Aktivität führen könnte.