dc.contributor.author
Löwenau, Lilian Julia
dc.date.accessioned
2018-06-07T17:13:38Z
dc.date.available
2016-12-09T10:47:03.709Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/3574
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-7774
dc.description.abstract
Reconstructed full-thickness skin (RHS) and reconstructed epidermis (RHE) has
proven a promising alternative to preclinical drug testing on animal (pig,
mouse) skin, which should be overcome both due to ethical concerns and
species-related differences that question the predictive power. Constructed
from juvenile cells, the available models omit changes that occur in the skin
during ageing. Reconstructed epidermis that can mimic age-related changes is
particularly relevant with regard to the growing population of elderly people.
Previous approaches to meet this need included the use of a glycated dermis
equivalent to reflect age-related glycosylation, or fibroblasts prematurely
aged by replicative senescence through prolonged cultivation or drug-induced
senescence by mitomycin treatment. Here, it was intended to induce senescence
in juvenile keratinocytes by UV-light and to construct UV-RHE. Single doses of
UV-B (25 mJ/cm2) are sufficient to cause senescence in keratinocytes, as
indicated by expression of senescence-associated (SA)-ß-galactosidase and
characteristic morphology (flattening, size increase and strong granulation).
Keratinocytes irradiated with 25 mJ/cm2 UV-B and one lower dose, 9.6 mJ/cm2,
and non-irradiated control keratinocytes, respectively, were seeded into
inserts and cultivated for 14 days to form normal RHE and UV-RHE. In parallel,
the effect of the UV irradiation on cell viability and proliferation was
investigated in keratinocyte monolayers. It was found that 25 mJ/cm2 UV-B
reduced the viability to about 30 % 72 h post-irradiation. The cell
proliferation decreased by about 25 % at the same dose after 72 h. Moderate
effects were detected for the lower dose. The normal and UV-RHE were
investigated after 14 days. The normal RHE displayed the appropriate regular
pattern of erect keratinocytes in the basal lamina and was fully stratified,
while the UV-RHE showed an irregular pattern, indicating disturbed
differentiation. The most obvious distinction was a dose-dependent reduction
in the epidermal layers: in 25 mJ/cm2 UV-RHE, the stratum corneum shrunk by 56
% (p≤0.01) and in 9.6 mJ/cm2 UV-RHE by about 30 %. The thickness of the viable
epidermis was also reduced, although less remarkably. Since the effects were
demonstrably not caused by fluctuations in the seeding numbers and the
keratinocyte count in normal and UV-RHE was not markedly changed, the
reduction presumably resulted from flattened keratinocytes and/or exfoliated
corneocytes. The thinning of the epidermal layers nicely paralleled the
epidermal atrophy in vivo, where senescent cells cause structural and
functional alterations of the tissue. In order to test the influence of the UV
stress on the secretion of pro-inflammatory cytokines, IL-1α, IL-6, IL-8,
IL-12, and TNFα were tested. Only IL-1α and IL-8 were above the detection
limit and were elevated in 25 mJ/cm2 UV-RHE throughout the cultivation by
about twofold compared to normal RHE. IL-1α levels were highest at day 2 and
preceded elevated IL-8 levels from day 7 to 14. Elevated IL-1α and IL-8 levels
are part of the senescence-associated secretory phenotype (SASP) that is
characteristic of the chronic inflammation of aged tissues. Increased
ß-galactosidase protein levels in tissue lysates were at least detectable for
two batches of 25 mJ/cm2 UV-RHE. Together with the monolayer results of
increased ß-galactosidase expression and the elevated IL-1α and IL-8 levels,
the existence of senescent cells in UV-RHE in accordance with ageing tissues
in vivo is strongly suggested. To investigate the barrier function of normal
and UV-RHE, the permeation of two OECD reference compounds was tested.
Caffeine and testosterone both permeated UV-RHE faster than normal RHE, and
despite relatively strong inter-batch differences clearly pointed to barrier
impairment in 25 mJ/cm2 UV-RHE in agreement with structural and functional
alterations of the stratum corneum in the elderly. Also, the uptake of core-
multishell (CMS-) nanocarriers was tested. CMS nanocarriers are promising as
efficient drug transporters for the treatment of skin diseases; yet their
penetration into aged skin with altered barrier function, critical for their
risk assessment, had not been investigated. In accordance with the decreased
barrier of 25 mJ/cm2 UV-RHE, an increased penetration of indocarbocyanine-
tagged nanocarriers by comparison to normal RHE of about twofold into the
stratum corneum and about six fold into the viable epidermis was detectable
via FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy). Taken together, a new
type of reconstructed epidermis was built from UV-B stressed keratinocytes
that was able to capture the most evident hallmarks of skin ageing in vivo.
The resemblance to aged human epidermis was given in terms of morphology,
increased IL-1α and IL-8 secretion, senescence-associated ß-galactosidase
expression and increased permeation and penetration.
de
dc.description.abstract
Rekonstruierte humane Vollhaut- (RHS) und Epidermismodelle (RHE) für die
präklinische Testung sind eine vielversprechende Alternative zu den ethisch
bedenklichen Tierversuchen. Ihr entscheidender Vorteil ist, dass sie, anders
als Schweine- oder Maushaut, aus menschlichen Zellen aufgebaut werden und
damit das Problem artspezifischer Unterschiede umgehen. Da RHS und RHE stets
aus juvenilen Spenderzellen generiert werden, sind die strukturellen und
funktionalen Unterschiede, wie sie in gealterter Haut auftreten, in diesen
Modellen bisher nicht ausreichend berücksichtigt. Aufgrund eines zunehmenden
Bevölkerungsanteils älterer Menschen ist die entsprechende Anpassung ein
wichtiges Ziel. Bisherige Ansätze zur Modellierung von Hautalterung
beinhalteten unter anderem die Verwendung eines gykosylierten
Dermisäquivalents sowie die Induktion von Seneszenz durch verlängerte
Kultivierdauer oder Gabe von Mitomycin. Der hier gewählte Ansatz beschreibt
die Induktion von Seneszenz in juvenilen Keratinozyten durch UV-Stress.
Einmalige Bestrahlung mit UV-B (25 mJ/cm2) kann Seneszenz in juvenilen
Keratinozyten hervorrufen, wie durch 1.5 fache Erhöhung seneszenz-assoziierter
ß-Galaktosidaseexpression und charakteristischer Veränderungen der
Zellmorphologie (Abflachung, Oberflächenvergrößerung und starke Granulierung
des Zytoplasmas) gezeigt. Mit zwei verschiedenen UV-Dosen (25 mJ/cm2; 9.6
mJ/cm2) bestrahlte Zellen, sowie die Zellen der unbestrahlten Kontrolle wurden
über 14 Tage zu normaler bzw. UV-RHE kultiviert. Der Effekt der UV-Strahlung
auf Viabilität und Proliferation wurde am Monolayer untersucht, mit bis zu 30
% verringerter Viabilität und 25 % verringerter Proliferation bei 25 mJ/cm2
UV-B 72 h nach der Bestrahlung. Nach dem Ende der 14-tägigen Kultivierung in
Inserts zeigte die normale RHE die angemessene Ausbildung aller epidermalen
Schichten sowie die typische, aufrechte Anordnung der Keratinozyten in der
Basalmembran. Die UV-RHE dagegen hatte eine unregelmäßige, auf eine gestörte
Differenzierung hinweisende Anordnung der basalen Keratinozyten. Am
auffälligsten war jedoch der dosisabhängige Dickenunterschied der epidermalen
Schichten. 25 mJ/cm2 UV-RHE hatte ein um durchschnittlich 56 % (p≤0.01)
verringertes Stratum corneum (circa 30 % in 9.6 mJ/cm2 UV-RHE). Die Dicke der
viablen Epidermis war ebenfalls verringert. Es konnte gezeigt werden, dass die
Effekte nicht von Schwankungen der ausgesäten Zellzahl ausgelöst wurden; auch
war die Gesamtanzahl der Zellen zwischen normaler und UV-RHE nicht auffällig
anders. Dies läßt den Rückschluß zu, dass die verringerte Dicke durch
abgeflachte und/oder die Abstoßung abgestorbener, verhornter Zellen zustande
kam. Die Verdünnung stimmt überein mit der epidermalen Atrophie gealterter
Haut, in der seneszente Zellen zu Struktur- und Funktionsveränderungen
beitragen. Darüber hinaus wurde die Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine
(IL-1α, IL-6, IL-8, IL-12 und TNFα) getestet. Nur IL-1α und IL-8 waren
oberhalb des Detektionslimits und über die gesamte Kulturdauer circa zweifach
erhöht in 25 mJ/cm2 UV-RHE gegenüber der normalen RHE. Der Spiegel an IL-1α
war maximal erhöht nach zwei Tagen und ging den erhöhten Spiegeln von IL-8
zwischen Tag 7 und 14 voraus. Erhöhte Sekretion von IL-1α und IL-8 sind Teil
des seneszenz-assoziierten sekretorischen Phenotyps (SASP), charakteristisch
für die chronischen, niedrigschwellig entzündlichen Prozesse, die in alter
Haut beobachtet wurden. Außerdem wurde in 25 mJ/cm2 UV-RHE von wenigstens zwei
Spendern erhöhte ß-Galaktosidaseexpression nachgewiesen. Zusammen mit den
entsprechenden Ergebnissen aus dem Monolayer und der erhöhten IL-1α und -8
Sekretion sprechen die Ergebnisse für das Vorhandensein seneszenter Zellen in
der UV-RHE, übereinstimmend mit dem Vorkommen seneszenter Zellen in gealterter
Haut. Zur Untersuchung der Barrierefunktion wurde die Permeation von zwei
OECD-Referenzsubstanzen getestet. Koffein und Testosteron permiierten durch
UV-RHE schneller als durch die normale RHE. Trotz relativ starker
spenderabhängiger Unterschiede wurde ein klarer Trend zur verringerten
Barrierefunktion in 25 mJ/cm2 UV-RHE festgestellt, in Übereinstimmung mit den
strukturellen und funktionalen Veränderungen des Stratum corneums in
gealterter Haut. Weiterhin wurde die Penetration von core-multishell- (CMS-)
Nanocarriern getestet, die als innovative Transportsysteme für Wirkstoffe zur
Behandlung von Hautkrankheiten entwickelt wurden. Obwohl bereits
vielversprechende Ergebnisse vorliegen, ist ihre Risikobewertung noch nicht
abgeschlossen; so wurden sie beispielsweise noch nicht auf der veränderten
Barriere von gealterter Haut getestet. Passend zur verringerten Barriere der
25 mJ/cm2 UV-RHE konnte eine gegenüber der normalen RHE zweifache (in das
Stratum corneum) und sechsfache (in die viablen Schichten) erhöhte Penetration
von mit Indocarbocyanin markierten Nanocarriern festgestellt werden
(detektiert mittels FLIM, Fluorescence lifetime imaging microscopy). Insgesamt
wurde eine neuartige rekonstruierte Epidermis aus UV-gestressten Keratinozyten
aufgebaut, die die wichtigsten Kennzeichen in vivo gealterter Haut abbilden
konnte. Die Ähnlichkeit zeigte sich in der Morphologie, erhöhter IL-1α und
IL-8 Sekretion, seneszenz-assoziierter ß-Galaktosidaseexpression sowie
erhöhter Permeation und Penetration.
de
dc.format.extent
89 Seiten
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
tissue engineering
dc.subject
reconstructed human epidermis
dc.subject
senescence-associated secretory phenotype
dc.subject
beta-galactosidase
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::571 Physiologie und verwandte Themen
dc.title
Human epidermis reconstructed from UV-B irradiated keratinocytes mimics
epidermal ageing
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Monika Schäfer-Korting
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Gerhard Wolber
dc.date.accepted
2016-11-30
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000103684-2
dc.title.translated
Humane Epidermis rekonstruiert aus UV-B bestrahlten Keratinozyten imitiert die
epidermale Hautalterung
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
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FUDISS_thesis_000000103684
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000020558
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