Enhancers and promoters are DNA sequences whose physical proximity, through chromatin looping, is a necessary condition to initiate gene transcription. Functional chromatin interactions are limited by topologically associating domains (TADs), structural regulatory units of the genome that constrain enhancer-promoter crosstalk. Recent studies have elucidated that an important role of the CCCTC-binding factor (CTCF) regulates in theT processes of TAD and loop formation. However, it remains unclear whether CTCF is indispensable to mediate enhancers-promoter interactions and to achieve precise spatio-temporal patterns of gene expression during development. To investigate this, we systematically deleted CTCF-binding motifs at the Epha4 locus in mice using CRISPR-Cas9 and evaluated the effects on chromatin organization and gene expressionfunctional consequences in vivo. We focused on two CTCF sites associated to an enhancer-promoter interaction that occurs during mouse limb development. Analysis of genome architecture showed that CTCF binding site deletions induce a complete depletion of enhancer-promoter interactions. Analysis of Epha4 expression levels revealed that while the enhancer-promoter loop is disrupted, up to 50% of physiological expression levels are be retained.
Our results suggest that the baseline proximity generated by topologically associated domains (TADs can be sufficient to fail-safe expressional output during developmentis sufficient to yield a certain amount of expressional output. Previous research on TADs has stressed their insulating properties - highlighting their function of restricting enhancer-promoter contacts over TAD boundaries. Our results stresshighlight an additional function of TADs in supporting enhancer-promoter communication and in sustaining developmental gene expression.
Enhancer und Promotoren sind DNA-Sequenzen, deren physische Nähe durch Chromatin-Schleifenbildung eine notwendige Voraussetzung für die Einleitung von Gentranskription ist. Solche Enhancer-Promoter-Interaktionen werden durch topologisch assoziierende Domänen (TADs) eingeschränkt. Neuere Studien haben gezeigt, dass der CCCTC-Bindungsfaktor (CTCF) die TAD und Chromatin-Schleifenbildung reguliert. Es bleibt jedoch unklar, ob CTCF unverzichtbar ist, um Enhancer-Promoter-Interaktionen zu vermitteln und präzise räumlich-zeitliche Muster von Genexpression während der Entwicklung zu erzielen. Um dies zu untersuchen, haben wir mit CRISPR-Cas9 systematisch CTCF-Bindungsmotive am E-pha4-Locus bei Mäusen deletiert und die Auswirkungen auf Genexpression und Chromatin-Architektur in vivo ausgewertet. Wir konzentrierten uns auf zwei Bindungsmotive, die mit einer Enhancer-Promoter-Interaktion verbunden sind, welche während der Entwicklung der Extremitäten der Maus auftritt. Die Analyse der Genomarchitektur zeigte, dass die Deletionen der CTCF-Bindungsstelle eine vollständige Erschöpfung der Enhancer-Promoter-Interaktionen induzieren. Die Analyse der Epha4- Expressionsniveaus zeigte, dass während die Enhancer-Promoter-Schleife unterbrochen ist, bis zu 50% des physiologischen Expressionsniveaus erhalten bleiben. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die durch topologisch assoziierte Domänen (TADs) erzeugte Basisfrequenz an Enhancer-Promoter-Kontakten ausreicht, um eine bestimmte Menge an expressivem Output zu erzielen. Frühere Forschungen über TADs haben hauptsächlich ihre isolierenden Eigenschaften betont - und ihre Funktion der Einschränkung von Enhancer-Promoter-Kontakten über TAD-Grenzen hinweg hervorgehoben. Unsere Ergebnisse unterstreichen eine zusätzliche Funktion von TADs bei der Unterstützung der Enhancer-Promotor-Kommunikation und bei der Aufrechterhaltung von Genexpression in der Entwicklung.
