Summary
In vitro selection of DNA molecules has become an extremely useful technique to investigate the interaction of proteins with DNA. In my thesis, I have extended the technique of in vitro selection to DNA molecules under torsional strain. Libraries of negatively supercoiled plasmids or minicircles, containing a block of randomized sequence, were prepared and used to in vitro select double-stranded DNA ligands of the Za domain of the human ADAR1 protein.
Under physiological conditions sequences of alternating purine and pyrimidine bases can adopt the Z-DNA conformation in the presence of negative supercoiling. The Za domain is the only known high affinity protein ligand for Z-DNA. Until now no definite proof existed whether binding of Za to DNA in addition to conformation specificity involves sequence specificity
Both the plasmid and minicircle libraries were successfully used in in vitro selection experiments with the Za domain. The common sequence motif of the selected DNA sequences were stretches of alternating purine and pyrimidine sequences, especially those rich in CG and GC dinucleotides. Formation of the Z-DNA conformation by the selected sequences was shown by DEPC footprinting. The calculated propensity of the selected sequences to form Z-DNA was significantly higher than would be expected for random sequences.
The analysis of the selected sequences did not indicate any sequence specificity of DNA binding by the Za peptide other than a preference for those sequences that most easily adopt the Z-DNA conformation. Similar results were obtained with Bandshift assays. I therefore propose that the Za domain binds to DNA conformation specific and has negligible or no sequence specificity.
In vitro Selektion von DNA Molekülen ist eine außerordentlich nützliche Methode, um die Interaktion von Proteinen mit DNA zu untersuchen. In meiner Dissertation habe ich die Technik der in vitro Selektion so erweitert, daß sie auch auf unter Torsionsspannung stehende DNA Moleküle angewandt werden kann. Negativ torsionsgespannte Plasmide und Minizirkel wurden hergestellt, die einen Block randomisierter Sequenz enthielten, und dann benutzt um doppelsträngige DNA Liganden für die Za Domäne des humanen ADAR1 Proteins zu selektieren.
Sequenzen von alternierenden Purin- und Pyrimidinbasen können bei Anwesenheit von negativer Torsionsspannung unter physiologischen Bedingungen die Z-DNA Konformation einnehmen. Die Za Domäne ist der einzige bekannte natürliche Protein Ligand für Z-DNA. Bisher war unbekannt, ob die Bindung von Za an DNA neben der Konformationsspezifität zusätzlich eine Sequenzspezifität aufweist.
Sowohl die Plasmid- als auch die Minizirkelbanken wurden erfolgreich in in vitro Selektionsexperimenten mit der Za Domäne eingesetzt. Das gemeinsame Merkmal der selektierten DNA Sequenzen waren Abfolgen von alternierenden Purin- und Pyrimidinbasen, besonders jedoch solchen, die reich und CG und GC Dinukleotiden waren. Die Ausbildung der Z-DNA Konformation durch die selektierten Sequenzen wurde mittels DEPC Reaktionen gezeigt. Die berechnete Z-DNA Bildungswahrscheinlichkeit der selektierten Sequenzen war signifikant höher, als für randomisierte Sequenzen erwartet.
Die Analyse der selektierten Sequenzen ergab keinen Hinweis auf eine Sequenzspezifität der Bindung des Za Peptides an DNA außer zu solchen Sequenzen, die besonders leicht die Z-DNA Konformation einnehmen. Ich komme deswegen zu dem Schluß, daß die Za Domäne an DNA konformationsspezifisch, jedoch mit zu vernachlässigen kleiner oder gar keiner Sequenzspezifität bindet.
