Functional analysis of albuminuria candidate genes in zebrafish

Abstract

The Munich Wistar Frömter (MWF) rat is a suitable inbred hypertensive rat model for chronic kidney disease (CKD) with albuminuria of early onset. Here, the MWF rat was used to decipher the genetic basis of albuminuria development in hypertension. Characterization of the genomic architecture of a previously identified CKD locus in MWF led to the identification of transmembrane protein 63c (Tmem63c) as a candidate for albuminuria with differential expression in glomeruli of allele-specific rat models during the onset of albuminuria in MWF. Recent studies identified Tmem63c as a potential hyperosmolarity-activated cation channel. Subsequent evaluation of the potential clinical relevance in human kidney biopsies revealed specific loss of TMEM63C in podocytes from patients with focal segmental glomerulosclerosis (FSGS). To analyze a putative role of tmem63c in maintaining glomerular filtration barrier (GFB) functionality, we performed studies in zebrafish as a second vertebrate animal model. We utilized morpholino antisense-oligonucleotides and CRISPR/Cas9-mediated somatic mutagenesis to knockdown tmem63c gene function in developing zebrafish embryos. Evaluation of GFB integrity was conducted in Tg[fabp10a:gc-EGFP] zebrafish embryos with the fluorescent albumin surrogate gc-EGFP circulating in the vascular system following 48 hours post fertilization (hpf). Leakage of gc-EGFP following GFB damage was assessed using epifluorescence microscopy. By using both knockdown techniques, tmem63c-deficiency resulted in similar mild edema at 48 hpf and an albuminuria-like phenotype showing a significant decrease of gc-EGFP-fluorescence in Tg[fabp10:gc-EGFP] at 120 hpf. Specificity of all knockdown systems and conservation of tmem63c gene function across species were shown by rescue of the observed albuminuria-like phenotype using zebrafish- or rat- derived mRNA, respectively. To analyze the ultrastructure of the GFB and the cellular composition of the glomerulus in Tg[wt1b:EGFP] embryos with fluorescent podocytes, we deployed electron and confocal microscopy, respectively. Ultrastructural analysis of the GFB upon tmem63c-deficiency revealed podocyte foot process effacement with significant increase in foot process width and decrease in the number of slit diaphragms per µm glomerular basement membrane. Quantification of podocyte cell number and density from confocal images revealed a significant increase in glomerular volume with accompanying decrease in podocyte density due to marked dilation of glomerular capillaries. The data suggests a crosstalk between damaged podocytes and vascular endothelium in the manifestation of the observed phenotype in zebrafish. Together, this study shows a conserved functional role of Tmem63c in albuminuria development across species and warrants further translational investigation of Tmem63c as a novel therapeutical target.

Die Munich Wistar Frömter (MWF) Ratte stellt ein interessantes genetisches Rattenmodell der chronischen Nierenerkrankung (CKD) dar und entwickelt bereits früh eine spontane Albuminurie. Anhand des MWF Tiermodells ist es möglich die genetische Basis der Entwicklung einer Albuminurie bei gleichzeitigem Vorliegen einer Hypertonie zu untersuchen. Eine tiefergehende Charakterisierung der genetischen Architektur eines zuvor identifizierten CKD-Lokus der MWF-Ratte führte zur Identifizierung von Transmembran Protein 63c (Tmem63c) als Albuminurie-Kandidatengen. Dieses Gen wurde kürzlich als ein möglicher hyperosmolar-aktivierter Kationenkanal identifiziert. In isolierten Glomeruli allel-spezifischer Rattenmodelle wies Tmem63c eine differentielle Expression zum Zeitpunkt des Einsetzens der Albuminurie im MWF-Modell auf. Die darauffolgende Analyse in humanen Nierenbiopsien zeigte einen Verlust von TMEM63C in Podozyten von Patienten mit fokaler segmentaler Glomerulosklerose (FSGS) und unterstützt die mögliche klinische Bedeutung des Kandidatengens. Untersuchungen im Zebrafischmodell dienten der Analyse der funktionellen Relevanz von tmem63c zur Aufrechterhaltung einer intakten glomerulären Filtrationsbarriere (GFB). Anhand von Morpholino Oligonukleotiden und CRISPR/Cas9-vermittelter somatischer Mutagenese wurden Zebrafischembryonen mit herunterregulierter tmem63c Genfunktionalität generiert. Mit Hilfe von Larven der Zebrafischlinie Tg[fabp10a:gc-EGFP], in deren vaskulärem System nach 48 Stunden nach der Befruchtung (hpf) das fluoreszierende Albuminsurrogat gc-EGFP zirkuliert, wurde die Integrität der GFB mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Dabei führte eine Störung der GFB zur freien Filtration von gc-EGFP und damit zum Fluoreszenzverlust. Beide verwendeten Knockdown-Techniken führten bei den Zebrafischembryonen gleichermaßen zur Entwicklung milder Ödeme 48 hpf sowie zu einem Albuminurie-ähnlichen Phänotyp mit einem signifikanten Verlust der gc-EGFP-Fluoreszenz in Tg[fabp10:gc-EGFP] 120 hpf. Sowohl die Spezifität der verwendeten Knockdown-Techniken als auch die Spezies-übergreifende Konservierung der Genfunktion von tmem63c wurde über eine Aufhebung des Albuminurie-ähnlichen Phänotyps nach Co-Injektion von Zebrafisch-bzw. Ratten-tmem63c-mRNA bewiesen. Die Ultrastruktur der GFB und die zelluläre Zusammensetzung des Glomerulus wurden in Tg[wt1b:EGFP]-Embryonen mit fluoreszierenden Podozyten mittels Elektronen- beziehungsweise Konfokalmikroskopie evaluiert. Die ultrastrukturelle Analyse der GFB bei tmem63c-Defizienz zeigte eine Ablösung der Podozytenfußfortsätze mit signifikanter Verbreiterung der Zellfortsätze und gleichzeitiger Reduktion der Anzahl von Schlitzdiaphragmata pro µm glomerulärer Basalmembran. Eine Quantifizierung der Podozytenzahl und -dichte mittels Konfokalmikroskopie ergab eine signifikante Erhöhung des glomerulären Volumens mit gleichzeitiger Erniedrigung der Podozytendichte durch eine deutliche Ektasie glomerulärer Kapillaren. Dies weist auf eine wechselseitige Beteiligung geschädigter Podozyten und des vaskulären Endothels bei der Manifestierung des beobachteten Phänotyps im Zebrafisch hin. Die hier vorliegende Arbeit identifiziert Tmem63c als Gen mit Spezies-übergreifender funktioneller Rolle bei der Entwicklung einer Albuminurie und legt eine weitergehende translationale Erforschung des Gens als potenziellen, neuen therapeutischen Ansatzpunkt nahe.