Generation of gallbladder organoids to study the genotoxic effect mediated by Salmonella Paratyphi A

Abstract

Gall bladder carcinoma is a highly deadly disease due the difficulties in its diagnosis. Observational studies found a strong correlation between the development of gall bladder cancer and Salmonella enterica serovar Typhi/Paratyphi A chronic carriage. If fact the CdtB subunit of its secreted typhoid toxin has DNase enzymatic activity, and is translocated to the nucleus of the host cell where it might cause DNA damage and facilitate to malignant transformation. Current studies on Salmonella-induced carcinogenesis largely relies on the use of already transformed or immortalized cell lines as in vitro models. However, such models are not the ideal tool for investigating the initial steps of carcinogenesis. Primary cells cultured with traditional methods, on the other hand, go promptly into senescence. Recently, the “organoid” model has been developed. This primary cell model is preferable for approximating the in vivo situation since it allows long term propagation of stable epithelial primary cells originating from human and murine tissue. This method relies on the maintenance of adult stemness using long-term defined culture conditions allowing the formation of 3-D structures in an extracellular matrix. In this study, I have successfully established a corresponding model from human and murine gall bladder primary cells. The adult stemness is maintained through activation of the Wnt/β-catenin pathway by its ligands Wnt and R-spondin. In parallel, I have identified Lgr5 as a stem cell marker of the adult gall bladder. The organoids recapitulate the tissue of origin in terms of protein markers and gall bladder functionality, and their phenotype is stable in time, having the capacity to self-renew. I subsequently infected human gall bladder organoids with the human-restricted, gall bladder cancer-linked pathogen Salmonella Paratyphi A. The infection leads to genotoxicity, which extends to the neighboring uninfected cells. Surprisingly, cells intoxicated with the typhoid toxin fail to arrest their cell cycle, despite harboring DNA breaks. Human gall bladder organoids represent an unprecedented tool to study tissue physiology and pathology. In addition, for the first time it is possible to infect the human epithelium of the gall bladder in vitro with human restricted Salmonellae, and elucidate the first events of cancer initiation and bacteria induced transformation.

Das Gallenblasenkarzinom ist eine oft tödlich verlaufende Krankheit, und Hauptproblem dabei ist vor allem die schwierige Diagnostik. Beobachtungsstudien ergaben eine hohe Korrelation zwischen dem Auftreten von Gallenblasenkrebs und chronischen Infektionen der Gallenblase mit Salmonellen (S. enterica Typhi bzw. S. Paratyphi A). Die CdtB-Untereinheit des von den Erregern sezernierten Typhustoxins besitzt DNase-Enzymaktivität und wird in den Kern von Wirtszelle transloziert; sie könnte dort DNA-Schäden verursachen und so die maligne Transformation begünstigen. Aktuelle Studien zur Salmonella-induzierten Karzinogenese berufen sich weitgehend auf der Verwendung bereits transformierter oder immortalisierter Zelllinien in Form von in-vitro-Modellen. Solche Modelle sind jedoch kein ideales Instrument, um den Beginn einer Karzinogenese zu untersuchen. Andererseits gestalteten sich Versuche mit Primärzellen, die mit traditionellen Methoden kultiviert wurden, bisher als schwierig, da die Zellen rasch in ein Stadium der Seneszenz übergehen. Kürzlich wurde das so genannte "Organoid"-Modell entwickelt. Dieses Primärzellmodell ermöglicht die langfristige Vermehrung stabiler epithelialer primärer Zellen sowohl aus menschlichem als auch aus murinem Gewebe und bildet daher der in-vivo-Situation angenäherte Bedingungen. Die Methode beruht auf der Erhaltung adulter Stammzellen in der Kultur mittels bestimmter Morphogene und einer definierten extrazellulären Matrix, die die Ausbildung von 3-D-Strukturen, den Organoiden, fördert. Im Rahmen meines Dissertationsprojektes gelang es mir, ein entsprechendes Modell aus menschlichen und murinen Gallenblasenprimärzellen zu etablieren. Adulte Stammzellen werden dabei mittels Aktivierung des Wnt / β-Catenin-Signalweges in Gegenwart von Wnt und R-Spondin Liganden erhalten. In diesem Zusammenhang gelang es mir auch, Lgr5 als Stammzellmarker der adulten Gallenblase zu identifizieren. Die Organoide entsprechen dem Ursprungsgewebe hinsichtlich Proteinmarker und Gallenblasenfunktionalität; ihr Phänotyp ist zeitlich stabil und sie besitzen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung. Auf dieser Grundlage konnte ich menschliche Gallenblasen-Organoide mit einem humanspezifischen Salmonella-Paratyphi-A-Erregerstamm erfolgreich infizieren. Die Infektion rief deutliche Anzeichen einer Genotoxizität hervor, die sich auch auf benachbarte, nicht infizierte Zellen erstreckte. Überraschenderweise vermag das von den Erregern gebildete Typhustoxin nicht, den Zellzyklus infizierter Zellen zu stoppen, obgleich diese DNA-Brüche aufweisen. Ein zentrales Ergebnis der vorliegenden Studie ist die Etablierung von Gallenblasenorganoiden, mittels derer die Gewebephysiologie und Pathologie untersucht werden kann. Darüber hinaus ist es mit meiner Arbeit erstmals gelungen, menschliches Epithel der Gallenblase in vitro mit humanspezifischen Salmonellen zu infizieren und so die frühen Stadien einer möglichen Bakterien-induzierten Transformation und Krebsentstehung zu erforschen.