Multivalent glycoarchitectures of different dimensions and their biological evaluation

Abstract

Within this thesis several novel glycoarchitectures were synthesized and their biological activities evaluated in Concanavalin A binding, selectin binding, and in the inhibition of influenza A virus infection. Mainly three relevant carbohydrates mannose (Man), Galactose (Gal), and sialic acid (SA) were involved by designing these glycoarchitectures presented on diverse scaffolds such as hyperbranched polyglycerols (hPG, 3 and 5 kDa), polyglycerol nanoparticles (nPG, 1000 kDa), glycerol dendrons, and gold nanoparticles (AuNPs). The size of these scaffolds varied from 2 up to 70 nm. The surface availability and bioactivity of Man and Gal modified polymers were evaluated using a competitive surface plasmon resonance spectroscopy (SPR)-based binding assay by interactions of the Man-glycopolymers with Concanavalin A (Con A, a Man binding lectin), and the Gal-glycopolymers with selectins, respectively. The results of these studies indicated that the designed glycopolymers acted multivalent. Higher sugar loadings onto the polymers promoted higher binding activity. The multivalent presentation of galactose (35 terminal Gal per polymer) significantly lowered the IC50 values of L-, P-, and E-selectin binding in a well-established competitive SPR based binding assay. Furthermore, the binding affinity to L- and especially to P- selectin was dramatically enhanced when sulfated Gal derivatives were used as ligands, resulting in IC50 values in the low nanomolar range. SPR results from Con A studies indicated that the novel glycoarchitectures were able to efficiently recognize Con A with IC50 values from the micro to the nanomolar range, while the corresponding monovalent methyl mannoside (methyl-Man) required millimolar concentrations. Precipitation assays were performed, to gain an insight into the stoichiometry of Con A binding per functionalized hPG. Furthermore, the flexibility of Man to hPG was tested by varying the spacer between the ligand and the scaffold. As carbohydrate flexibility has already been induced (at least partly) by the PG scaffold, smaller rigid spacers were chosen and the best one was determined by several measurements. These studies suggest that for further improvement of the binding affinity, not a higher functionalization, but an increase in size of the hPG core should be appropriate to provide more space for protein binding. In the case of influenza virus inhibition the objective was how particle size and valency affect the inhibition process on scaffolds of different dimensions. Following the concept of multivalency, weak single molecule interactions of sialylated dendrons were disproportionately enhanced by presenting them on a scaffold (AuNPs with different dimensions: 2 nm and 14 nm) in a multivalent manner. Sialylated particles of 14 nm size were found to be effective for influenza virus inhibition, whereas 2 nm analogs did not show significant impact. AuNPs of 2 nm dimension span three binding sites of an individual hemagglutinin (HA) homotrimer, whereas the 14 nm ones could bind several HA trimers. For the first time, the multiple binding of these modified AuNPs to influenza viruses could be directly visualized by electron microscopic imaging. Furthermore, the polymer particle sizes were varied along with the degree of functionalization (SA density) to match the corresponding virus size and receptor multiplicity in order to improve affinity. The inhibitory activity of the tested polymeric nanoparticles on influenza virus drastically increased with the nanoparticle size, as observed by virus binding, fusion, and infectivity studies. Larger particles, of dimensions similar to that of a virus (50 nm), showed very efficient virus inhibition (up to 80 %). Additionally it was found that presentation of carbohydrates on polymeric nanoparticles at higher density does not necessarily exhibit higher inhibitory potential. A saturation point in the degree of surface functionalization was observed, whereby inhibition was not significantly improved. This can be explained by the given geometry of both interacting surfaces. This study emphasizes the importance of matching particle size and ligand density for biological surface interactions.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden mehrere neuartige dendritische Glykokonjugate synthetisiert, ihre Bindungsfähigkeit an die biologisch wichtigen Lektine Concanavalin A und Selektin, sowie die Inhibitionswirkung auf die Zelladhäsion von Influenza A Viren untersucht. Hauptsächlich wurden drei relevante Kohlenhydrate - Mannose (Man), Galaktose (Gal) und Sialinsäure (SA) - für die terminale Funktionalisierung dieser neuen Glykoarchitekturen verwendet. Als Gerüstmoleküle dienten unterschiedlich strukturierte Polyglycerine: hyperverzweigtes Polyglycerin (hPG, 3 und 5 kDa), nano-Polyglycerinpartikel (nPG, 1000 kDa), Glycerol Dendrone und Goldnanopartikel (AuNP), wobei die Größe dieser Gerüste von 2 bis 70 nm variierte. Die Oberflächenverfügbarkeit und Bioaktivität von Man und Gal modifizierten Polymeren wurden durch Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR) basierten Bindungstests ermittelt. Dabei wurden die Wechselwirkungen der Man-Glykopolymere mit Concanavalin A (Con A, ein Man bindendes Lektin) und der Gal-Glykopolymere mit Selektinen getestet. Die Ergebnisse dieser Studien zeigten, dass die verwendeten Glykopolymere in einer multivalenten Art und Weise binden. Eine erhöhte Funktionalisierung der Polymere mit Kohlenhydraten führte zu einer Erhöhung der Bindungsaktivität. Die multivalente Präsentation von Gal (35 terminale Gal-Einheiten pro Polymer) senkte deutlich die IC50-Werte bei der L-, P- und E-Selektin Bindung in einem SPR-Bindungstest. Die Bindungsaffinität an L- und vor allem P-Selektin wurde drastisch erhöht, wenn sulfatierte Gal als Liganden verwendet wurden, was zu IC50-Werte im nanomolaren Bereich führte. SPR Ergebnisse von Con A Studien wiesen darauf hin, dass die neuartigen Glycoarchitekturen in der Lage sind effizient Con A zu binden. Die IC50-Werte lagen dabei im mikro- bzw. nanomolaren Bereich, während die entsprechenden monovalenten Methyl-Mannoside (Methyl-Man) millimolare Konzentrationen erforderten. Die Stöchiometrie der Bindung zwischen Con A und Kohlenhydrat-funktionalisierten Polymer wurde durch Fällungstests genauer untersucht. Des Weiteren wurde die Linkerflexibilität durch Variation der Bindungseinheit zwischen dem Man-Liganden zum hPG-Polymer systematisch geändert. Da eine grundsätzliche Flexibilität am Kohlenhydrat bereits teilweise durch die recht flexible Polymerstruktur gewährleistet ist, wurde eine Serie von kurzen, starren Linkern untersucht und die optimalen Bindungsparameter in mehreren Messreihen ermittelt. Diese Studien legen nahe, dass für eine weitere Verbesserung der Bindungsaffinität nicht etwa eine höhere Funktionalisierung, sondern eine Vergrößerung der hPG-Gerüststrukturen notwendig ist, um eine größere Anzahl von effektiven Bindungsstellen für die Proteinbindung zu erhalten. Die Untersuchung von Glykokonjugaten hinsichtlich relevanter Parameter wie Partikelgröße und den Einfluß von Valenz auf die Inhibition der Influenzavirus-Zelladhäsion war ein weiteres Forschungsziel dieser Arbeit. Nach dem Konzept der Multivalenz wurden schwache Wechselwirkungen einzelner Moleküle sialylierter Dendrone überproportional verstärkt, indem sie auf einem Gerüstmolekül (AuNPs mit unterschiedlichen Abmessungen: 2 nm und 14 nm) in multivalenter Weise präsentiert wurden. Sialylierte Partikel von 14 nm Größe erwiesen sich als wirksam bei der Influenza-Virus-Hemmung, während die 2 nm Analoga kaum Hemmung zeigten. 2 nm große AuNPs konnten drei Bindungsstellen eines einzelnen Hämagglutinin (HA) Homotrimer besetzen, während die 14 nm großen AuNPs mehrere HA Trimere binden konnten. Zum ersten Mal konnte die mehrfache Bindung dieser modifizierten AuNPs an Influenza-Viren direkt mit elektronenmikroskopischen Aufnahmen dargestellt werden. Die Partikelgrößen und der Grad der Funktionalisierung (SA-Dichte) polymerer Gerüste wurde ebenfalls variiert, um diese der entsprechenden Virusgröße und Rezeptormultiplizität anzupassen und somit die Affinität zu verbessern. Die hemmende Wirkung der getesteten Glykokonjugate auf Influenzaviren stieg drastisch mit zunehmender Partikelgröße, wie Bindungs-, Fusions- und Infektionstests zeigten. Größere Partikel wie nano- Polyglycerinen, mit Virus-ähnlichen Abmessungen von ca. 50 nm, zeigten eine sehr effiziente Vireninhibition. Es wurde festgestellt, dass eine höhere Funktionalisierung dieser polymeren Nanopartikel mit Kohlenhydraten nicht automatisch zur weiteren Erhöhung der inhibitorischen Wirkung führt. Es wurde vielmehr ein Sättigungpunkt im Oberflächenfunktionalisierungsgrad beobachtet, ab dem die Hemmung nicht mehr signifikant verbessert wurde, was durch die vorgegebene Geometrie der beiden wechselwirkenden Oberflächen gedeutet werden kann. Diese Studie unterstreicht daher die Bedeutung passender Partikelgrößen, Partikelformen, sowie der Ligandendichte für effiziente Wechselwirkungen biologisch relevanter Oberflächen.