Introduction Fundamental advances in genotyping and gene sequencing technologies have led to a rapidly increasing identification of common and rare genetic variants associated with human traits and diseases. However, molecular mechanisms underlying these associations often remain elusive. In this thesis, three functional studies are summarized that were performed to follow-up on such association signals:
1) Common and rare genetic variants in the SH2B3 gene are associated with elevated red blood cell (RBC) counts. Thus, it was investigated whether perturbation of SH2B3 can improve the in vitro production of RBCs, an alternative approach to obtain RBCs for transfusion. 2) A high-throughput reporter assay of common genetic variants associated with RBC traits in a recent genome-wide association study (GWAS) was used to identify novel casual variants and to investigate their mechanisms of action. 3) Exome sequencing and follow-up studies were performed to identify rare genetic variants in a family affected by an enigmatic mitochondrial disorder.
Methods Patient-derived cells, cDNAs, shRNAs and genome editing approaches were utilized to modulate the expression of candidate genes. Primary cells and cell lines were cultured and analyzed using in vitro and in silico approaches including flow cytometry, Western blotting and microscopic imaging. To screen common genetic variants for regulatory function a massively parallel reporter assay (MPRA) was utilized.
Results 1) Perturbation of SH2B3 resulted in markedly increased yields of in vitro produced RBCs without compromising maturation or quality of the obtained RBCs. 2) MPRA identified endogenous regulatory elements and 32 MPRA functional variants of which 10-16 are casually related to the GWAS phenotype. For a subset of these variants target genes were identified and one variant was mechanistically linked back to the phenotype. 3) Exome sequencing identified PMPCA mutations in patients affected by a rare mitochondrial disorder which are suggested to result in impaired processing of a mitochondrial precursor protein.
Conclusion 1) Perturbation of SH2B3 can augment the in vitro production of RBCs, pointing to the potential to use insight from genetic variation to improve cell and tissue replacement therapies. 2) We demonstrate that MPRAs can be an elegant tool to narrow down GWAS-nominated common variants to a reduced set of leads for further investigation. 3) Exome sequencing and follow-up studies represent a promising strategy to identify the molecular etiology of previously enigmatic genetic disorders.
Moderne DNA-Sequenzierungsmethoden haben zur Entdeckung einer stetig wachsenden Anzahl häufiger und seltener genetischer Varianten geführt, die mit bestimmten humanen Merkmalen oder Krankheiten assoziiert sind. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind jedoch in den meisten Fällen unklar, da zu deren Verständnis weiterführende funktionelle Untersuchungen notwendig sind. In der vorliegenden Arbeit werden drei solcher follow-up Studien vorgestellt: 1) Varianten des humanen SH2B3 Gens sind mit erhöhten Erythrozytenzahlen assoziiert. Daher wurde untersucht, ob eine Inaktivierung von SH2B3 die in vitro Produktion von reifen roten Blutzellen (RBZs) verbessern kann, einem alternativen Verfahren zur Herstellung von Erythrozytenkonzentraten. 2) Es wurde eine Multiplex-Untersuchung häufiger genetischer Varianten durchgeführt, die in einer genomweiten Assoziationsstudie (GWAS) mit Erythrozyten-Merkmalen assoziiert sind, um kausale Varianten und zugrunde liegende Mechanismen zu identifizieren. 3) Exom-Sequenzierungen und zellbiologische follow-up Untersuchungen wurden durchgeführt, um die Ätiologie einer mitochondrialen Erkrankung zu ergründen. Methodik Von Patienten isolierte Zellen, shRNA-vermittelter Knockdown und Genome Editing wurden angewendet, um die Expression von Kandidatengenen in primären Zellen und Zelllinien zu modulieren und den resultierenden Phänotyp untersuchen zu können. Mehrere bioinformatische und zellbiologische Methoden wurden verwendet, darunter Durchflusszytometrie, Western Blots und Lichtmikroskopie. Um gleichzeitig eine Vielzahl von genetischen Varianten einer GWAS zu untersuchen, wurde ein kürzlich entwickelter Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) angewendet. Ergebnisse 1) Ein Knockdown des SH2B3 Gens führte zu einer deutlich ansteigenden Anzahl in vitro produzierter RBZs, ohne die Differenzierung oder Qualität der Zellen zu beeinträchtigen. 2) Mittels MPRA konnten endogen regulatorische Elemente und so 32 MPRA Functional Variants identifiziert werden, von diesen stehen ca. 10-16 in kausalem Zusammenhang mit dem Phänotyp. Für einen Teil dieser Varianten werden zugrundeliegende Mechanismen und Zielgene beschrieben und es wird ein funktioneller Zusammenhang einer Variante mit dem ursprünglichen GWAS-Phänotyp aufgezeigt. 3) Mittels Exom-Sequenzierung wurden Mutationen des PMPCA Gens entdeckt, die mit einer schweren mitochondrialen Erkrankung assoziiert sind und zur gestörten Prozessierung eines mitochondrialen Precursor-Proteins führen. Schlussfolgerung 1) Eine genetische Inaktivierung von SH2B3 erhöhte die Ausbeute in vitro produzierter RBZs. Dies zeigt das Potential auf, genetische Variationsstudien gezielt zur Verbesserung von Zell- und Gewebeersatztherapien zu nutzen. 2) Mittels MPRA können GWAS-Befunde deutlich eingegrenzt werden, was eine gezieltere funktionelle Untersuchung einzelner Varianten ermöglicht. 3) Exom-Sequenzierung und gezielte follow-up Untersuchungen erlauben die molekulare Ätiologie zuvor unverstandener genetischer Erkrankungen zu charakterisieren.
