dc.contributor.author
Lobitz, Stephan
dc.date.accessioned
2018-06-07T17:08:40Z
dc.date.available
2012-11-21T07:49:16.121Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/3464
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-7664
dc.description.abstract
Die Transkriptionsfaktoren ETV6 und RUNX1 sind essenzielle Regulatoren der
Häma-topoese. Durch die kryptische chromosomale Translokation
t(12;21)(p13;q22), die bei ca. 25% der akuten lymphoblastischen Leukämien
(ALL) im Kindesalter nachweisbar ist, entsteht das Fusionsgen ETV6/RUNX1, das
zur Bildung eines aberranten Fusionspro-teins führt. Essenzielle
regulatorische Funktionen beider Transkriptionsfaktoren werden dadurch
nachhaltig gestört. Die exakten Bedeutungen von ETV6 und RUNX1 in der
Hämatopoese sind noch nicht abschließend geklärt. Ebenso ist die Rolle des
Fusions-proteins in der Leukämogenese bislang unklar. In verschiedenen Studien
wurde versucht, die Expression des Fusionstranskriptes mit Hilfe von RNA-
Interferenzstrategien posttranskriptionell zu unterdrücken. Dies gelang nur
mit begrenztem Erfolg. Das liegt wahrscheinlich daran, dass siRNA-basierte
Eingriffe in die Genregulation nur dann spezifisch sein können, wenn die
verwendete siRNA exakt den ETV6/RUNX1-Fusionsbereich als Ziel hat. Alle
anderen Sequenzen kommen nicht nur im Fusionsgen sondern auch im zweiten ETV6-
bzw. im zweiten RUNX1-Allel vor. Im Fusionsbereich bietet sich aber kein
optimales siRNA-Ziel. Hammerhead-Ribozyme sind sehr kurze, katalytisch
wirksame RNA-Moleküle, die in der Lage sind, definierte RNA-Sequenzen zu
schneiden. Sie sind damit potenziell ebenso geeignet, die Expression von Genen
posttranskriptionell zu regulieren wie inter-ferierende RNA-Moleküle. Für
Ribozyme gelten zwar grundsätzlich die gleichen Ein-schränkungen wie für
siRNA. Aufgrund des gänzlich unterschiedlichen Wirkmechanis-mus gelang einer
koreanischen Arbeitsgruppe aber dennoch ein Ribozym mit Wirksam-keit gegen
ETV6/RUNX1 zu identifizieren. Das Einbringen regulatorisch wirksamer RNA-
Entitäten durch lentivirale Transduktion hat den wesentlichen Vorteil, dass
der entsprechende Nukleinsäureabschnitt stabil in das Genom der Zielzelle
integriert wird und deswegen nicht in zukünftigen Zellteilungen verloren geht.
Außerdem können zusätzliche Sequenzen in die Zielzellen eingebracht werden,
die wiederum die Expression des regulatorisch wirksamen RNA-Moleküls be-
einflussen. Dadurch lassen sich Regulationseffekte gewissermaßen an- und
abschalten. Im Rahmen dieser Dissertation wurde das bekannte, die Expression
von ETV6/RUNX1 posttranskriptionell beeinflussende Hammerhead-Ribozym mit der
Bezeichnung buRz28 lentiviral in eine selbst generierte
ETV6/RUNX1-exprimierende Modellzelllinie eingebracht und untersucht, ob das
lentiviral transferierte Ribozym ebenso wirksam ist wie das episomal durch
Transfektion eingebrachtes Ribozym. Es konnte gezeigt werden, ➢ dass die
Modellzelllinie HT-1080 nach Transduktion mit einem selbst klonierten
lentiviralen Vektor stabil ETV6/RUNX1 exprimiert, ➢ dass sich die ETV6/RUNX1
exprimierenden HT-1080-Zellen lentiviral mit dem Ribozym buRz28 transduzieren
ließen, ➢ und dass das lentiviral eingebrachte Ribozym buRz28 zu einer
posttranskriptio-nellen Herabregulierung der Genexpression führt. Die in
dieser Arbeit verwendete Methodik ist sehr innovativ. Bislang gibt es kaum
Publi-kationen zu lentiviral vermitteltem Ribozymtransfer. Diese Technik
könnte sich als gute Alternative zur posttranskriptionellen
Genexpressionshemmung erweisen, insbesondere dann, wenn die Zielsequenz kein
geeignetes Ziel für siRNA bietet.
de
dc.description.abstract
The transcription factors ETV6 and RUNX1 are essential regulators of
haematopoiesis. The cryptic translocation t(12;21)(p13;q22) found in about 25%
of childhood acute lymphoblastic leukaemia, results in the fusion gene
ETV6/RUNX1, which gives rise to an aberrant fusion protein and causes
significant alterations of essential regulatory tasks of both transcription
factors. However, to date, the exact relevance of ETV6 and RUNX1 in
haematopoiesis and leukaemogenesis is not clear. Several studies aimed at the
posttranscriptional inhibition of the fusion transcript by means of RNA
interference with limited success. siRNA based interference of gene regulation
is only specific, if it targets the ETV6/RUNX1 fusion region exactly. Any
other sequence is not only part of the fusion gene, but also of the second
ETV6 or RUNX1 allele, respectively. However, the fusion region does provide an
optimal target for siRNA. Hammerhead ribozymes are very short RNA molecules
with catalytic activity able to cut defined RNA sequences. Hence, they are
potentially as suitable to regulate gene expression poststranscriptionally as
are interfering RNA molecules. Anyway, the same restrictions apply for
ribozymes as do for siRNA. Nevertheless, due to a completely different
mechanism of action, a Korean group was able to identify a ribozyme with
activity against ETV6/RUNX1. Delivery of regulatory RNA entities by lentiviral
transduction has the significant advantage of stable integration of the
respective nucleic acid into the host cell genome. Thus, the sequence does not
get lost during future divisions of the cell. Moreover, additional sequences
can be co-delivered, which may control the expression of regulatory RNA
molecules. Thereby, regulatory effects can be switched on and off. In this
dissertation, the hammerhead ribozyme buRZ28, which was known to inhibit the
expression of ETV6/RUNX1 posttranscriptionally, was delivered lentivirally
into a self-generated ETV6/RUNX1 expressing model cell line. Subsequently, it
was studied if the lentiviral transfer of the ribozyme was as effective as the
introduction of the ribozyme in an episomal manner. It could be demonstrated,
that (a) the model cell line HT-1080 stably expressed ETV6/RUNX1 after
transduction with a self-designed lentiviral vector, that (b) ETV6/RUNX1
expressing HT-1080 cells could be transduced lentivirally with the ribozyme
buRz28 and that (c) lentivirally transferred buRz28 was able to silence gene
expression posttranscriptionally. The methodology used in this work is very
innovative. To date, there is hardy any publication on lentiviral ribozyme
transfer. This technique could be a suitable alternative in studies of
posttranscriptional gene expression, which is particular true, if there is no
appropriate target for siRNA in the respective sequence.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
lentiviral gene transfer
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Posttranskriptionelle Expressionshemmung von ETV6/RUNX1 durch lentivirale
Transduktion mit dem Ribozym buRz28
dc.contributor.contact
stephan.lobitz@charite.de
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. K. Seeger
dc.contributor.furtherReferee
Priv.-Doz. Dr. med. H. Cario
dc.contributor.furtherReferee
Priv.-Doz. Dr. med. A. Claviez
dc.date.accepted
2012-11-30
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000039414-6
dc.title.translated
Posttranscriptional silencing of ETV6/RUNX1 by lentiviral transduction with
the ribozyme buRZ28
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000039414
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000012180
dcterms.accessRights.dnb
free
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open access