Die Transkriptionsfaktoren ETV6 und RUNX1 sind essenzielle Regulatoren der Häma-topoese. Durch die kryptische chromosomale Translokation t(12;21)(p13;q22), die bei ca. 25% der akuten lymphoblastischen Leukämien (ALL) im Kindesalter nachweisbar ist, entsteht das Fusionsgen ETV6/RUNX1, das zur Bildung eines aberranten Fusionspro-teins führt. Essenzielle regulatorische Funktionen beider Transkriptionsfaktoren werden dadurch nachhaltig gestört. Die exakten Bedeutungen von ETV6 und RUNX1 in der Hämatopoese sind noch nicht abschließend geklärt. Ebenso ist die Rolle des Fusions-proteins in der Leukämogenese bislang unklar. In verschiedenen Studien wurde versucht, die Expression des Fusionstranskriptes mit Hilfe von RNA- Interferenzstrategien posttranskriptionell zu unterdrücken. Dies gelang nur mit begrenztem Erfolg. Das liegt wahrscheinlich daran, dass siRNA-basierte Eingriffe in die Genregulation nur dann spezifisch sein können, wenn die verwendete siRNA exakt den ETV6/RUNX1-Fusionsbereich als Ziel hat. Alle anderen Sequenzen kommen nicht nur im Fusionsgen sondern auch im zweiten ETV6- bzw. im zweiten RUNX1-Allel vor. Im Fusionsbereich bietet sich aber kein optimales siRNA-Ziel. Hammerhead-Ribozyme sind sehr kurze, katalytisch wirksame RNA-Moleküle, die in der Lage sind, definierte RNA-Sequenzen zu schneiden. Sie sind damit potenziell ebenso geeignet, die Expression von Genen posttranskriptionell zu regulieren wie inter-ferierende RNA-Moleküle. Für Ribozyme gelten zwar grundsätzlich die gleichen Ein-schränkungen wie für siRNA. Aufgrund des gänzlich unterschiedlichen Wirkmechanis-mus gelang einer koreanischen Arbeitsgruppe aber dennoch ein Ribozym mit Wirksam-keit gegen ETV6/RUNX1 zu identifizieren. Das Einbringen regulatorisch wirksamer RNA- Entitäten durch lentivirale Transduktion hat den wesentlichen Vorteil, dass der entsprechende Nukleinsäureabschnitt stabil in das Genom der Zielzelle integriert wird und deswegen nicht in zukünftigen Zellteilungen verloren geht. Außerdem können zusätzliche Sequenzen in die Zielzellen eingebracht werden, die wiederum die Expression des regulatorisch wirksamen RNA-Moleküls be- einflussen. Dadurch lassen sich Regulationseffekte gewissermaßen an- und abschalten. Im Rahmen dieser Dissertation wurde das bekannte, die Expression von ETV6/RUNX1 posttranskriptionell beeinflussende Hammerhead-Ribozym mit der Bezeichnung buRz28 lentiviral in eine selbst generierte ETV6/RUNX1-exprimierende Modellzelllinie eingebracht und untersucht, ob das lentiviral transferierte Ribozym ebenso wirksam ist wie das episomal durch Transfektion eingebrachtes Ribozym. Es konnte gezeigt werden, ➢ dass die Modellzelllinie HT-1080 nach Transduktion mit einem selbst klonierten lentiviralen Vektor stabil ETV6/RUNX1 exprimiert, ➢ dass sich die ETV6/RUNX1 exprimierenden HT-1080-Zellen lentiviral mit dem Ribozym buRz28 transduzieren ließen, ➢ und dass das lentiviral eingebrachte Ribozym buRz28 zu einer posttranskriptio-nellen Herabregulierung der Genexpression führt. Die in dieser Arbeit verwendete Methodik ist sehr innovativ. Bislang gibt es kaum Publi-kationen zu lentiviral vermitteltem Ribozymtransfer. Diese Technik könnte sich als gute Alternative zur posttranskriptionellen Genexpressionshemmung erweisen, insbesondere dann, wenn die Zielsequenz kein geeignetes Ziel für siRNA bietet.
The transcription factors ETV6 and RUNX1 are essential regulators of haematopoiesis. The cryptic translocation t(12;21)(p13;q22) found in about 25% of childhood acute lymphoblastic leukaemia, results in the fusion gene ETV6/RUNX1, which gives rise to an aberrant fusion protein and causes significant alterations of essential regulatory tasks of both transcription factors. However, to date, the exact relevance of ETV6 and RUNX1 in haematopoiesis and leukaemogenesis is not clear. Several studies aimed at the posttranscriptional inhibition of the fusion transcript by means of RNA interference with limited success. siRNA based interference of gene regulation is only specific, if it targets the ETV6/RUNX1 fusion region exactly. Any other sequence is not only part of the fusion gene, but also of the second ETV6 or RUNX1 allele, respectively. However, the fusion region does provide an optimal target for siRNA. Hammerhead ribozymes are very short RNA molecules with catalytic activity able to cut defined RNA sequences. Hence, they are potentially as suitable to regulate gene expression poststranscriptionally as are interfering RNA molecules. Anyway, the same restrictions apply for ribozymes as do for siRNA. Nevertheless, due to a completely different mechanism of action, a Korean group was able to identify a ribozyme with activity against ETV6/RUNX1. Delivery of regulatory RNA entities by lentiviral transduction has the significant advantage of stable integration of the respective nucleic acid into the host cell genome. Thus, the sequence does not get lost during future divisions of the cell. Moreover, additional sequences can be co-delivered, which may control the expression of regulatory RNA molecules. Thereby, regulatory effects can be switched on and off. In this dissertation, the hammerhead ribozyme buRZ28, which was known to inhibit the expression of ETV6/RUNX1 posttranscriptionally, was delivered lentivirally into a self-generated ETV6/RUNX1 expressing model cell line. Subsequently, it was studied if the lentiviral transfer of the ribozyme was as effective as the introduction of the ribozyme in an episomal manner. It could be demonstrated, that (a) the model cell line HT-1080 stably expressed ETV6/RUNX1 after transduction with a self-designed lentiviral vector, that (b) ETV6/RUNX1 expressing HT-1080 cells could be transduced lentivirally with the ribozyme buRz28 and that (c) lentivirally transferred buRz28 was able to silence gene expression posttranscriptionally. The methodology used in this work is very innovative. To date, there is hardy any publication on lentiviral ribozyme transfer. This technique could be a suitable alternative in studies of posttranscriptional gene expression, which is particular true, if there is no appropriate target for siRNA in the respective sequence.
