Hintergrund: Die Aufklärung genetischer Ursachen seltener, angeborener Erkrankungen ist oft schwierig und zeitintensiv. Das Ziel dieser Arbeit war die Identifikation der zugrundeliegenden Genmutation für ein bislang nicht beschriebenes kongenitales Myasthenie-Syndrom (CMS) bei weiblichen monozygoten Zwillingen, die Muskelschwäche, Makrozephalie und Großwuchs aufweisen. Methodik: Mithilfe einer Gesamtexomsequenzierung und verschiedener computergestützter Methoden suchte ich nach potentiell krankheitsverursachenden DNA-Varianten und priorisierte diese hinsichtlich ihrer mutmaßlichen Pathogenität. Dazu führte ich eine ausführliche Literaturrecherche durch und in Zusammenschau der klinischen und molekulargenetischen Informationen habe ich letztlich einige wenige Kandidatenvarianten selektiert. Anschließend führte ich eine Segregationsanalyse mittels konventioneller Sanger-Sequenzierung durch und bestätigte so das Vorhandensein der pathogenen Variante im CHD8 Gen der Patientinnen. Zur Darstellung der subzellulären Lokalisation und der strukturellen Funktion an der neuromuskulären Endplatte (NME) habe ich Immunofluoreszenz-Färbungen von CHD8, Rapsyn, β-Catenin (βCAT) und Golgin auf Fibroblasten unserer Patientinnen und gesunden Kontrollen durchgeführt. Im Verlauf wurden weitere Färbungen auf humanen und murinen Kontrollmuskelschnitten angefertigt. Ergebnisse: Ich identifizierte eine spontane missense Mutation im CHD8 Gen [chr14:g.21,884,051G>A, GRCh37.p11 | c.1732C>T, NM_0011 7062 | p.(R578C)], das für das Chromodomain helicase DNA binding protein 8 (CHD8) kodiert. Klinisch wurden bisher Mutationen in CHD8 beschrieben, die mit Autismus-Spektrums-Störung (ASS) in Kombination mit fazialen Dysmorphien, Hochwuchs und Makrozephalie einhergehen. Bislang war eine Funktion von CHD8 an der NME sowie eine Assoziation mit muskulären Symptomen nicht bekannt. Auf der zellulären Ebene ist CHD8/Duplin für die Regulation der WNT/βCAT-Signalkaskade und für die Chromatin-Remodellierung zuständig. βCAT spielt außerdem eine Rolle in der strukturellen Integrität der NME. Immunofluoreszenz- Färbungen gegen Rapsyn und CHD8 auf Kontrollmuskelschnitten bestätigten die Expression von CHD8 an der NME sowie eine Kolokalisation mit Rapsyn und βCAT. Zusammenfassung: Die von mir identifizierte heterozygote de novo Mutation in CHD8 führt sehr wahrscheinlich zum CMS unserer Patientinnen. Der Hochwuchs sowie die Makrozephalie überlappen mit der CHD8-assoziierten Unterform der ASS und ihren phänotypischen Charakteristika. Die muskulären Symptome stellen neue Erkenntnisse dar. Basierend auf meinen Erkenntnissen aus Literatur und Labor gehe ich von einer strukturbildenden Funktion von CHD8 an der NME aus. Ich vermute zusätzlich eine Rolle in der Formation der NME über die Regulation der Genexpression via WNT. Die vorliegenden Ergebnisse erweitern das klinische Spektrum der CMS und sollten in Zukunft im Rahmen der molekularen Diagnostik berücksichtigt werden.
The correct diagnosis of rare, genetic diseases is difficult to obtain and patients often have to wait several years until they are correctly diagnosed. The aim of this work was to find the genetic basis of a novel congenital myasthenic syndrome (CMS) in female monozygotic twins suffering from muscle weakness, overgrowth, and macrocephalus. Methods: With help of Whole Exome Sequencing (WES) and different in silico methods, I searched for and prioritized potential disease-causing DNA variants. A thorough and extensive literature research together with the synopsis of the clinical and molecular genetic findings, led me to a shortlist of several candidate variants. Next, I used conventional Sanger sequencing for segregation analysis and could confirm the presence of the pathogenic variant in the CHD8 gene and its absence in the parents. To explore the subcellular location and an assumed function of CHD8 at the neuromuscular junction (NMJ), I conducted immunofluorescence stainings for CHD8, rapsyn, β-catenin (βCAT), and golgin, both on patient and control fibroblasts. In the course of the project, this was also done in human and mouse control muscle sections. Results: I identified a spontaneous de novo missense mutation in CHD8 [chr14:g.21,884,051G>A, GRCh37.p11 | c.1732C>T, NM_00117062 | p.(R578C)], the gene encoding chromodomain helicase DNA binding protein 8 (CHD8), which I deem responsible for the symptoms seen in our patients. Clinically, mutations affecting CHD8 are known to a cause a subtype of autism spectrum disorder (ASD) with characteristics like facial dysmorphism, overgrowth, and macrocephalus. To date, no associations of CHD8 with a function at the NMJ or neuromuscular symptoms as seen in our patients have been reported. CHD8/Duplin plays a role in the regulation of the Wingless-related integration site (WNT) pathway via interaction with βCAT and in chromatin remodeling for transcriptional regulation. βCAT on the other hand is known to be implicated in correctly building the structure of the NMJ. I could demonstrate the presence of CHD8 at the NMJ with immunofluorescence stainings on human and mouse control muscle sections, where CHD8 colocalized with rapsyn und βCAT at its sarcoplasmic side. Conclusion: The heterozygous de novo variant in CHD8, which I detected, is very likely to cause the CMS of our patients. They display overgrowth and macrocephaly, which overlaps with the CHD8-associated subtype of ASD and its morphological characteristics. The muscular phenotype in our patients is a novel finding. My hypothesis was that CHD8 plays a structural role at the NMJ and in its transcriptional regulation via the WNT pathway and βCAT interaction. The findings broaden the clinical spectrum of CMS and might be considered for future approaches in diagnosing genetic causes of CMS.
