Aspects of Astrocytic Calcium Signaling: A Role for NAADP+ and for Temperature

Abstract

Astrocytes constitute the largest glial cell population within the mammalian brain. A major part of astrocytic intra- and intercellular signaling occurs through dynamic changes in the cytosolic Ca2+ concentration. For a better insight into astrocytic reactions to changes in their environment, the specifics of this cellular Ca2+ code need to be understood. Here, the action of the recently discovered Ca2+-releasing second messenger NAADP+ on astrocytes is reported. Murine cortical astrocytes in culture and in acutely prepared slices respond with transient intracellular Ca2+ increases to extracellularly applied NAADP+. Evidence for connexin hemichannel-mediated cellular uptake and for intracellular activity of NAADP+ was found. Apart from a partial dependence on intact endoplasmatic reticulum Ca2+ stores, and on the activity of voltage-gated Ca2+ channels, lysosomes were critically involved in the NAADP+-mediated signaling. This is the first time lysosomes were shown to play a role in astrocytic Ca2+ signaling. Extracellular degradation of NAADP+ to adenosine or its direct action on adenosine receptors also provides a large part of its intracellular signal, as revealed by the P1 receptor inhibitor CGS-15943. In addition, astrocytes express the NAADP+-synthesizing enzyme CD38 in situ. These findings suggest that NAADP+ is a functional signalling molecule, adding to the complexity of information encoding by Ca2+ in astrocytes. In a separate series of experiments, it was found that increased Ca2+ signaling in astrocytes in perfused acute cortical slices is caused by the decrease in temperature from 30-33 degrees Celsius to room temperature (22-24 degrees Celsius), that accompanies switching off the perfusion. Basal Ca2+ signaling in astrocytes was inversely related to temperature. Phototoxicity contributed to the high basal activity at room temperature, but not at higher temperatures (30-38 degrees Celsius). Astrocytic swelling and NO are involved in the Ca2+ signaling activity, triggered in astrocytes by a decrease in temperature. In the presence of mannitol, used to reduce swelling, no oscillations were induced by switching off the perfusion. Investigating the contribution of different transmitter systems, only the NOS inhibitor L-NNA decreased the number of reacting cells. Also, the NO donor SNOG mimicked the effect of the stop of perfusion, by inducing oscillatory Ca2+ activity in a similar population of astrocytes, as switching off the perfusion did. These results have methodological implications, since altered Ca2+ signaling behavior renders studies on astrocytes at room temperature prone to artifacts. Moreover, these results contribute to the mechanistic knowledge of hypothermia on a cellular level, which could ultimately be of clinical relevance, since the neuroprotective effect of mild hypothermia is still rather empirical, and cryopreservation of nervous tissue needs to be optimized.

Astrozyten stellen die größte Zellpopulation im zentralen Nervensystem der Säugetiere dar. Ein Großteil der intra- und interzellulären Signaltransduktion dieser Zellen wird durch dynamische Änderungen ihrer zytosolischen Ca2+-Konzentration vermittelt. Aufgrunddessen ist es essentiell, die Spezifität des astrozytären Ca2+-Kodes zu verstehen, um eine bessere Einsicht in astrozytäre Reaktionen auf Änderungen ihrer Umgebung zu gewinnen. In der vorliegenden Arbeit wird über die Wirkungweise des vor kurzem entdeckten, Ca2+ freisetzenden, intrazellulären Botenstoffes NAADP+ im Hinblick auf Astrozyten berichtet. Kortikale Astrozyten der Maus in akut präparierten Gehirnschnitten reagieren mit vorübergehenden Erhöhungen des intrazellulären Ca2+-Spiegels auf extrazellulär appliziertes NAADP+. Es wurden Hinweise auf Konnexin-Hemikanal abhängige zelluläre Aufnahme, und für intrazelluläre Aktivität von NAADP+ gefunden. Neben einer partiellen Abhängigkeit von intakten endoplasmatisch-retikulären Ca2+-Speichern und spannungsabhängigen Ca2+-Kanälen, sind Lysosomen kritisch involviert in NAADP+-induzierter Signaltransduktion. Somit wird erstmalig gezeigt, dass Lysosomen eine Rolle in astrozytärer Ca2+-Signaltransduktion spielen. Durch Verwendung des P1 Rezeptor Inhibitors CGS-15943 wurde festgestellt, dass ferner extrazelluläre Degradation von NAADP+ zu Adenosin oder die direkte Aktivierung von P1 Rezeptoren durch NAADP+ einen Großteil zum NAADP+ induzierten Signal beitragen. Weiterhin exprimieren Astrozyten das NAADP+ synthetisierende Enzym CD38 in situ. Aufgrund dieser Ergebnisse muss NAADP+ als Signaltransduktionsmolekül, welches zur Komplexität der astrozytären Informationskodierung durch Ca2+ beiträgt, betrachtet werden. In einer zusätzlichen, unabhängigen Serie von Experimenten wurde ermittelt, dass eine erhöhte Ca2+-Signaltransduktionsaktivität in akuten, kortikalen Gehirnschnitten der Maus die Konsequenz eines Temperaturabfalls von 30-33 Grad Celsius auf Raumtemperatur (22-24 Grad Celsius) ist, welcher durch das Ausschalten der Perfusion bedingt ist. Die basale Ca2+-Signaltransduktionsaktivität zeigte eine inverse Abhängigkeit von der Temperatur. Fototoxizität steuert zu einer hohen Basalaktivität bei Raumtemperatur, jedoch nicht bei höheren Temperaturen (30-38 Grad Celsius) bei. Ein Anschwellen von Astrozyten, sowie NO, tragen zu dieser durch Temperaturabfall bedingten Ca2+-Aktivität bei. Das zur Suppression von Schwellungen verwendete Mannitol konnte die durch Temperaturabfall induzierten Ca2+-Oszillationen verhindern. Von verschiedenen Transmittersystemen, die auf einen Beitrag hin getestet wurden, konnte nur der NOS Inhibitor L-NNA die Anzahl der reagierenden Zellen reduzieren. Desweiteren konnte der NO Donor SNOG den Effekt des Ausschaltens der Perfusion derart nachahmen, dass er oszillatorische Ca2+-Aktivität in einer ähnlichen Zellpopulation auslöste, wie das Ausstellen der Perfusion selbst. Diese Ergebnisse sind von methodologischer Bedeutung, da verändertes Ca2+-Signaltransduktionsverhalten Astrozyten betreffende Studien bei Raumtemperatur anfällig für Artefakte macht. Weiterhin tragen diese Ergebnisse zum mechanistischen Verständnis von Hypothermie auf zellulärer Ebene bei. Dieses könnte letztendlich von klinischer Relevanz sein, da der neuroprotektive Effekt milder Hypothermie noch immer empirisch ist, und ausserdem eine Optimierung der Kryopräservation von Nervengewebe notwendig ist.