Neurons communicate via chemical synapses through the exocytosis of neurotransmitter-filled vesicles at the presynaptic active zone. Before exocytosis, synaptic vesicles are recruited to the presynaptic active zone membrane and become membrane-docked by a network of presynaptic proteins. The efficiency of exocytosis is determined by molecular priming factors that reduce the energy barrier between the synaptic vesicles and the presynaptic membrane, and couple Ca2+ channels to the primed synaptic vesicles. Rab3 interacting molecule (RIM) is a multidomain scaffolding protein in the active zone that participates in all steps of neurotransmission. RIM tethers synaptic vesicles to the presynaptic membrane and at the same time interacts with Ca2+ channels to modulate their function and to recruit them to the release sites. In addition, RIM activates the core of synaptic vesicle docking and priming, Munc13. Munc13 isoforms determine the number of readily-releasable synaptic vesicles and different forms of short-term plasticity. Due to the tightly overlapping, yet partially independent functions of RIM and Munc13, the RIM’s direct contribution to synapse functions is still unclear. Here, we investigated how RIM individually determines the synapse ultrastructure and function. For this purpose, we altered the expression of RIM and/or Munc13 isoforms in primary mouse hippocampal neurons and performed high-pressure freezing for electron microscopy, as well as electrophysiological recordings in autaptic cultures. We showed that RIM, independent from Munc13-1, localizes synaptic vesicles close to the AZ membrane and regulates the efficiency of synaptic vesicle release. However, both RIM and Munc13-1 contribute to synaptic vesicle docking and priming. Notably, in the absence of RIM and Munc13-1, the brain-specific isoform of Munc13-2 determines the size of the readily releasable synaptic vesicle pool at rest and after high frequency stimulation. Considering the critical role of RIM and Munc13 in different neurotransmission steps, this study deepens our understanding of how these molecules work in the presynaptic terminal to fulfill neurotransmission.
Neuronen kommunizieren über chemische Synapsen durch den Vorgang der Exozytose, welcher die Fusion von Neurotransmittern gefüllten Vesikeln mit der präsynaptischen Membran beschreibt. Damit Vesikel mit der Membrane fusionieren können, müssen sie über ein präsynaptisches Proteinen-Netzwerk zur Membran rekrutiert und gebunden werden. Ebenfalls muss für eine effiziente Exozytose die Energiebarriere zwischen den synaptischen Vesikeln und der präsynaptischen Membran verringert werden, was durch zusätzliche „Priming“-Faktoren und die Rekrutierung von Kalzium-Kanäle geschieht. Ein wichtiges Molekül in der Rekrutierung von Vesikeln ist das Rab3-interagierende Molekül (RIM), welches Vesikel an die präsynaptische Membran bindet und gleichzeitig Kalzium-Kanälen rekrutiert. Zusätzlich steigert RIM die Rekrutierung und Anlagerung von Vesikeln an die präsynaptische Membran durch die Aktivierung des präsynaptischen Proteins Munc13. Dabei kann die Wahrscheinlichkeit der Exozytose durch die Expression verschiedener Munc13-Isoformen bestimmen werden. Aufgrund der eng überlappenden, jedoch teilweise unabhängigen Funktionen von RIM und Munc13 ist der direkte Beitrag von RIM in der Rekrutierung von Vesikeln bisher unklar. In dieser Arbeit untersuchten wir den individuellen Beitrag von RIM auf die Exozytose, indem wir den Einfluss von RIM auf die synaptische Funktion und Ultrastruktur untersuchten. Zunächst haben wir die Expression von RIM- und / oder Munc13-Isoformen in primären hippokampalen Neuronen der Maus variiert und die Veränderungen in synaptischer Struktur und Funktion mit Hilfe der Elektronenmikroskopie und Elektrophysiologie charakterisiert. Die Analyse ergab, dass RIM unabhängig von Munc13-1 synaptische Vesikel in der Nähe der AZ-Membran lokalisiert und somit die Effizienz der Freisetzung synaptischer Vesikel reguliert. Ebenfalls konnten wir Unterschiede zwischen den Munc13-Isoformen aufzeigen. Dabei ist von besonderem Interesse, dass in Abwesenheit von RIM und Munc13-1, Munc13-2 die Effizienz der Freisetzungswahrscheinlichkeit synaptischer Vesikel in Ruhe und nach Hochfrequenzstimulation bestimmt. In Anbetracht der entscheidenden Rolle von RIM und Munc13 in verschiedenen Schritten der Neurotransmitterfreisetzung vertieft diese Studie unser Verständnis wie diese Moleküle im präsynaptischen Terminal arbeiten, um effiziente Neurotransmission zu ermöglichen.
