Einleitung: Ein Myokardinfarkt führt zum Untergang von kontraktilem Gewebe. Auf der Suche nach alternativen Ansätzen für die Behandlung des akuten Myokardinfarkts bietet die Stammzell- und Gentherapie interessante Möglichkeiten. Ziel der vorliegenden Arbeit war es eine kardiomyozytäre Zellfraktion aus dem humanen subkutanen Fettgewebe zu isolieren. Methoden: Unter Verwendung von klonierten lentiviralen Vektoren in denen die kardialen Promotoren pNkx2.5 und pMLC-2v die Expression der Reportergene eGFP und DsRed2 kontrollierten, wurden die humanen ADSCs infiziert. Die infizierten ADSCs wurden durch FACS fraktioniert und unter anderem mittels RT-PCR, Immunzytochemie, Calcium-Imaging, Patch-Clamp und Zellzyklusanalysen charakterisiert. Des Weiteren wurde der Effekt einer Inkubation mit 5-Azacytidine auf die Nkx2.5-gekoppelte eGFP-Expression untersucht. Ergebnisse: Es zeigte sich, dass ein bestimmter Subtyp von eGFPpos/DsRed2pos- Zellen zwischen 0,7-2,5% der ADSCs ausmachte. Diese Zellen zeigten ein von den anderen ADSC-Fraktionen unterschiedliches Genexpressionsprofil. Sie wiesen das höchste Expressionsniveau der kardialen Marker Nkx2.5 und MLC-2v auf. Als einzige Subpopulation exprimierten sie Troponin I. Diese Ergebnisse konnten durch immunzytochemische Analysen bestätigt werden. Die eGFPpos/DsRed2pos- Zellen konnten in vitro expandiert werden, ohne ihre kardiomyozytäre Genexpression einzubüßen. Die molekularen Marker quergestreifter Muskulatur MyoD und Myogenin wurden nicht nachgewiesen. Eine skelettmuskuläre Differenzierung ist somit unwahrscheinlich. Die Präsenz von spannungsabhängigen L-Typ-Calcium- und Kaliumkanälen wurde durch RT-PCR, Immunzytochemie, Calcium-Imaging und Patch Clamp-Analysen bestätigt. Die durchgeführte Zellzyklusanalyse ergab, dass der Großteil der eGFPpos /DsRed2pos-Zellen den Mitosemarker Ki-67 exprimierte. Zwischen 15-25% der eGFPpos/DsRed2pos-Zellen befanden sich in der S-Phase des Zellzyklus. Die Induktionsversuche mit 5-Azacytidine resultierten in einer dosisabhängigen, signifikanten Verringerung der Nkx2.5-gekoppelten eGFP-Exprimierung. Bemerkenswerterweise war die eGFP-Expression ohne 5-Azacytidine-Zusatz im Medium am höchsten ausgeprägt. Diskussion: Die vorgelegten Daten konnten zeigen, dass das humane subkutane Fettgewebe eine Fraktion von spontan differenzierenden kardiomyozytären Zellen enthält, welche mehrere wesentliche Charakteristika von adulten Kardiomyozyten aufwiesen. Unser Ansatz des Gentransfers liefert möglicherweise ein System zur Isolierung von geeigneten humanen adulten kardiomyozytären Zellen für die Therapie des akuten Myokardinfarkts.
Introduction: Myocardial infarction (MI) leads to a loss in cardiac tissue. Cardiac repair using cellular therapies is one potential conceivable new therapeutic option. In this study we investigated the potential of human adipose-derived stem cells (ADSCs) to differentiate into cardiomyogenic cells. Methods: For analytical purposes we cloned two HIV-based lentiviral vectors in which Nkx2.5 and MLC-2v promoters controlled the expression of the fluorescent dyes eGFP and DsRed2. ADSCs were infected with both lentiviral vectors simultaneously and 48-72h later analyzed by FACS. EGFPpos/DsRed2pos-cells were investigated using e.g. RT-PCR, immunohistochemistry, Fura-2-calcium imaging, patch clamp and cell cycle analysis. Results: Between 0.7-2.5% among regular ADSCs expressed eGFP and DsRed2 simultaneously. Sorted eGFPpos/DsRed2pos-cells expressed cardiomyocyte-specific mRNAs including: Nkx2.5, MLC-2v, GATA-4, Troponin I and L-type calcium channel alpha-1c subunit (Cav1.2). The skeletal markers MyoD, Myogenin were not detected. 15-20% of eGFPpos/DsRed2pos-cells showed L-type calcium channel specific response and patch clamp analysis revealed cardiac potassium channel presence in some cells. Cell cycle analysis showed that 20% of the cells were in the S-phase and more than 60% expressed mitosis marker Ki-67. Conclusion: Our studies indicate that spontaneously transdifferentiating cardiomyogenic cells can be isolated from ADSCs in vitro using lentiviral fluorescent indicators and FACS. The isolated cells did not resemble a fully differentiated cardiac phenotype yet showed several characteristics of adult cardiomyocytes.
