Molecular characterization of human mesenchymal stem cell differentiation to identify biomarkers for quality assurance in stem cell therapy

Abstract

Human mesenchymal stem cells (MSC) are promising candidates for regenerative medicine. Obviously, for practical and regulatory issues, knowledge of transdifferentiation (conversion of one lineage cells into another), new biomarkers characterizing MSC and their differentiated progeny could be crucial. However, after differentiation, whether stem cells increase or decrease their potency and stemness abilities, and whether transdifferentiation proceeds via a direct cell-to-cell conversion or needs dedifferentiation, is not adequately answered. Moreover, little is known about MSC and their adipogenic progeny in terms of lineage specific gene filtration, biomarker selection and matrix analysis. To investigate such issues, MSC were differentiated into adipogenic, osteogenic and chondrogenic lineage cells, and then the vital cells were isolated from their differentiated matrix. Subsequently, in different approaches, the isolated cells were used for the experiments of transdifferentiation, identification of new gene and glycan based biomarkers, matrix analysis, and cellular migration. In this work, it is shown that transdifferentiation was successful via dedifferentiation as confirmed by single cell analysis. On molecular level, a fine tuned association of cell cycle arrest (DHCR24, G0S2, MAP2K6, SESN3, RB1) and progression (CCND1, CHEK, HGF, HMGA2, SMAD3, CCPG1, RGS2) genes with transdifferentiation was observed. However, the direct transdifferentiation (without dedifferentiation) of adipogenic lineage cells into osteogenic or chondrogenic resulted in mixed cultures of both lineage cells (adipogenic and new acquiring osteogenic/chondrogenic phenotypes), as confirmed by histology and significantly upregulated gene expression of PPARG, FABP4, SPP1, RUNX2, SOX9, and COL2A1. Beside transdifferentiation, the differentiated cells were screened for the identification of biomarkers. Not only a new method “reverse adipogenesis” for fat marker filtration was established, but also 4 new fat markers APCDD1, CHI3L1, RARRES1, and SEMA3G were identified. Apart from this, glycan based biomarkers were discovered (H6N5F1, H7N6F1, and S1H7N6F1 for MSC; highly expressed levels of biantennary fucosylated and sialylated structures for fat cells). Beside biomarker identification, differentiated cells were analyzed for their secreted matrix. Collagen type I, II and IV filaments were found in the adipogenic matrix. The genetic machinery behind the matrix was identified with a significantly regulated expression of COL4A1, GPC1, GPC4, ITGA7, ICAM3, SDC2, TIMP4, BGN, CLDN11, ITGA2, ITGB1, and LAMA3. Next, the directional cell migration was investigated, and similar migration rates for both, chondrogenically differentiated cells and MSC towards the stimulus of CCL25 chemokine were found. The presented data of transdifferentiation, gene and glycan based biomarkers for identification and tracking of cells, matrix analysis and directional cell migration could be vital for quality assurance in stem cell therapy.

Humane mesenchymale Stammzellen sind vielversprechende Kandidaten für Anwendungen in der regenerativen Medizin. Für praktische und regulatorische Fragen ist dabei das Wissen über Transdifferenzierungsprozesse der Zellen (Umwandlung von einer Zelldifferenzierungslinie in ein andere), sowie über neue Biomarker zur Charakterisierung von MSC und deren differenzierten Nachkommen von entscheidender Bedeutung. Jedoch bleibt die Frage, ob Stammzellen ihre Potenz und ihre Stammzellfähigkeiten nach Differenzierungen verlieren oder ob sie diese Merkmale behalten oder sogar verbessern. Weiterhin ist es noch nicht ausreichend beantwortet, ob Transdifferenzierungen über eine direkte Zell-zu-Zell Umwandlung ablaufen oder eine Dedifferenzierung benötigen. Darüber hinaus ist nur wenig über MSC und deren adipogen differenzierte Nachkommen in Bezug auf Linien-spezifische Genfiltration, Biomarker Auswahl und Matrixanalyse bekannt. Um solche Probleme zu untersuchen, wurden MSC in die adipogene, osteogene und chondrogene Richtung differenziert, und anschließend vitale Zellen aus ihrer differenzierten Matrix isoliert. Anschließend wurden die isolierten Zellen in verschiedenen Ansätzen für die Experimente zur Transdifferenzierung, Identifizierung neuer Gen- und Glykan-basierter Biomarker, Matrixanalyse und Zellmigration verwendet. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Transdifferenzierung über einen Dedifferenzierungsschritt erfolgreich war. Dies konnte durch eine Einzelzellanalyse bestätigt werden. Auf molekularer Ebene konnte eine fein abgestimmte Assoziation der Zellzyklusarrest-spezifischen Gene (DHCR24, G0S2, MAP2K6, SESN3 und RB1) und der Gene der Progression (CCND1, CHEK, HGF, HMGA2, SMAD3, CCPG1 und RGS2) mit der Transdifferenzierung festgestellt werden. Allerdings führte die direkte Transdifferenzierung (ohne Dedifferenzierung) von adipogen differenzierten Zellen in die osteogene oder chondrogene Richtung zu Mischkulturen beider Zelltypen (adipogener und neu entwickelter osteogener/chondrogener Phänotyp), wie durch histologische Färbungen und die deutlich erhöhten Genexpressionen von PPARG, FABP4, SPP1, RUNX2 , SOX9 und COL2A1 bestätigt werden konnte. Neben der Transdifferenzierung wurden die differenzierten Zellen auch zur Identifizierung neuer Biomarker untersucht. Dabei konnte nicht nur eine neue Methode "reverse Adipogenese" für die Fettmarker Filtration etabliert werden, sondern es wurden auch 4 neue Fettmarker APCDD1, CHI3L1, RARRES1 und SEMA3G identifiziert. Abgesehen davon wurden Glykan-basierte Biomarker entdeckt (H6N5F1, H7N6F1 und S1H7N6F1 für MSC; stark exprimierte, biantennär fukosylierte und sialylierte Strukturen für Fettzellen). Neben der Identifizierung der Biomarker erfolgte die Untersuchung der sezernierten Matrix von differenzierten Zellen. In der adipogenen Matrix wurden Filamente von Kollagen Typ I, II und IV gefunden. Bei der Indentifizierung der genetischen Maschinerie hinter der Matrix zeigte die Expression von COL4A1, GPC1, GPC4, ITGA7, ICAM3, SDC2, TIMP4, BGN, CLDN11, ITGA2, ITGB1 und LAMA3 eine signifikante Regulierung. Als nächstes wurde die gerichtete Zellwanderung untersucht und eine ähnliche Migrationsrate für chondrogen differenzierte Zellen und MSC in Richtung des Chemokins CCL25 als Stimulus gefunden. Die gewonnenen Erkenntnisse über die Transdifferenzierung, die Gen- und Glykan-basierten Biomarker zur Identifizierung und Nachverfolgung von Zellen, der Matrix Analyse und der gerichteten Zellwanderung könnten entscheidend für die Qualitätssicherung in der Stammzelltherapie sein.