Glutamat-Aufnahme und -Freisetzung durch Astrozyten nach Clostridium botulinum C3-Protein-Behandlung

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Clostridium botulinum C3-Protein auf die Glutamat-Aufnahme und –Freisetzung kultivierter Maus- Astrozyten untersucht. Zunächst konnten Ergebnisse vorangegangener Arbeiten zum Einfluss von C3bot auf die Astrozytenmorphologie sowie die damit einhergehende Verminderung des Proteinniveaus von RhoA bestätigt werden. In C3bot-behandelten Kulturen konnte eine gegenüber der Kontrolle signifikant gesteigerte Aufnahme von Tritium-markiertem Glutamat gemessen werden. Die anschließenden immunzytochemischen sowie proteinbiochemischen Untersuchungen der Glutamattransporter belegen, dass die Expression des Plasmamembrantransporters GLT-1 signifikant gesteigert, die Expression von GLAST jedoch nicht wesentlich beeinflusst wurde. Pharmakologische Versuche zur selektiven Hemmung der Transportaktivität von GLT-1 konnten bestätigen, dass die beobachtete vermehrte Glutamat-Aufnahme nach Inkubation mit C3bot auf der Aktivität dieses Transportersubtyps beruht. Weiterhin zeigte sich, dass auch die vesikulären Glutamattransporter VGLUT1, 2 und 3 in den untersuchten Kulturen exprimiert wurden, sie in ihrem Proteinniveau jedoch nicht durch C3bot beeinflusst werden konnten. Die verstärkte Hemmung der Glutamat-Aufnahme durch BafilomycinA1 nach Behandlung mit C3bot legt aber eine vermehrte Beteiligung vesikulärer Speicherprozesse nahe. Die Behandlung mit C3bot führte weiterhin zu einer gesteigerten Ca2+-abhängigen Sekretion von Glutamat, wie die Stimulation mittels der Ca2+-Ionophore Ionomycin zeigte. In proteinbiochemischen Versuchen konnte dabei eine deutlich gesteigerte Expression des SNARE-Proteins Synaptobrevin nachgewiesen werden. Die Visualisierung und Quantifizierung von vesikulären Fusionsereignissen mit der Plasmamembran über den dabei aufgenommenen Farbstoff AM1-43 lieferte starke Hinweise auf vermehrte Exo-Endozytose-Ereignissse nach Behandlung mit C3bot. Letztendlich bestätigt wurden diese Hinweise auf eine gesteigerte exozytotische Freisetzung von Glutamat durch den Einsatz von Clostridium botulinum Neurotoxin D, welches die C3bot-vermittelte vermehrte Freisetzung von Glutamat zum größten Teil blockierte. Die durchgeführten Arbeiten belegen für Rho-Proteine eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Aufnahme und Freisetzung des wichtigsten exzitatorischen Transmitters durch Astrozyten und somit vermutlich auch für die Glutamat-Homöostase im ZNS. Sie legen weiterhin nahe, dass die bislang beobachteten Effekte von C3 Proteinen auf neuronales Wachstum möglicherweise auch auf indirekt vermittelten, glialen Effekten beruhen.

In the present paper the influence of Clostridium botulinum C3-protein on the glutamate uptake and release in cultivated mice-astrocytes was determined. First of all the results of previous works on the influence of C3bot on astrocyte morphology and the associated decrease of RhoA-proteinlevels could have been validated. In C3bot-treated cultures a significant increase of the uptake of tritium-labelled Glutamate could have been measured. The following studies of the glutamate-transporters showed that the expression of transporter GLT-1 was increased significantly and the expression of GLAST was rarely affected. Pharmacological studies could verify, that the increase in glutamate-uptake relies on the activity of this transporter. Furthermore it was shown that also vesicular glutamate transporters such as VGLUT1-3 were expressed, but not influenced by C3bot in the analyzed cultures. Despite this the increased inhibition of glutamate uptake by bafilomycinA1 after C3bot- treatment suggests an involvement of vesicular storage processes. The C3bot- treatment also led to an increase of Ca2+-dependent secretion, as shown with the Ca2+-Ionophore Ionomycin. In further studies a significantly increased expression of SNARE-protein Synaptobrevin could have been demonstrated. Visualization and quantification of vesicular fusion events with the plasma membrane via AM1-43 dye supplied evidence of augmented numbers of these events after treatment with C3bot. These indications of increased exocytotic glutamate release were confirmed via Clostridium botulinum Neurotoxin D, which could block most of the C3bot-associated release. The conducted experiments proved a determing role for Rho-proteins in regulation of uptake and release of the most important excitatory transmitter and therefor also for the whole glutamate-homeostasis in the CNS. They also suggest that previous shown effects of C3bot-proteins on neuronal growth could possibly also rely on indirect-mediated, glial effects.