Inter-individual variation in nitrogen and phosphorus metabolism and excretions in lactating Holstein dairy cows

Abstract

Cattle husbandry constitutes a major source of anthropogenic nitrogen (N) and phosphorus (P) losses associated with negative effects on human, animal and environmental health. Thus, particularly in light of a growing global human population and dwindling global resources, there is a demand to develop holistic emission mitigation approaches that concurrently promote a sustainable and efficient handling of available resources. Initial mitigating attempts primarily focused on nutritional strategies such as reducing N and P content of feed, while maintaining a constant energy level, in order to ameliorate utilization efficiency of ingested N and P for milk production in dairy cows. Milk urea N (MUN) concentration was shown to linearly correlate with urinary urea excretions, thus enabling the prediction of urinary N emissions and the assessment of dietary N supply. A higher P utilization efficiency (Peff), defined as the ratio between milk P secretion and P ingested, was assumed to reduce the fecal P load in dairy cows, since more P is channeled into milk. So far, variation in MUN concentration and Peff appear to be a result of a combinatory effect between animal genetic and feed composition. Thus, selectively breeding for low MUN concentration and high Peff dairy cows may potentially contribute attenuating urinary N and fecal P load and facilitating a more sustainable dairy industry. However, a significant portion of inter-individual variation in MUN concentration and Peff and underlying physiological mechanisms are largely unknown. Thus, the objective of the present thesis was to elucidate physiological and molecular mechanisms affecting inter-individual variation in MUN concentration and Peff in lactating Holstein dairy cows. Results are implicated to contribute in assessing the mitigation potential of selectively breeding on MUN concentration and Peff, while concomitantly precising feeding strategies to attenuate the environmental N and P footprint of cattle husbandry. The first study focused on clarifying physiological mechanisms involved in the regulation of urea metabolism and associated N excretions in dairy cows with divergent MUN concentrations. For this purpose, 20 German Holstein dairy cows were purchased in pairs, comprising one cow high (277 mg/L; n = 10) and one low (189 mg/L; n = 10) in MUN concentration, but were comparable in lactation period, body weight and milk production. After transported to the institutional barn of the Research Institute for Farm Animal Biology (FBN, Dummerstorf, Germany), cows were fed two different planes of dietary crude protein (13.8% vs. 15.9% in dry matter). After a two-week feed adaptation period within a loose housing system, we conducted a 2-day indirect calorimetry and a 4-day N balance with 13C urea isotope tracer study in tie stalls. Our study revealed, MUN groups did not differ in either fecal N, urinary urea or urinary N excretions despite fed the same feed composition. The latter results have been attributed to differences in renal performance concerning the overall renal glomerular filtration rate and specifically the renal clearance rate of urea. Interestingly, high MUN cows excreted less urinary creatine independent of protein feeding and less urinary uric acid on the low protein diet than low MUN cows. However, since urinary urea accounts for 75% of whole urinary N and MUN groups did not differ in overall urinary N excretion, we concluded high and low MUN cows not to differ in terms of nitrous oxide or ammonia emissions. In contrast, a reduction in dietary crude protein level considerably attenuated urinary N excretions with simultaneously improving N utilization efficiency for milk production. The second study aimed to elucidate underlying physiological and molecular mechanisms affecting P and N excretions of dairy cows differing in Peff. To this end, 20 German Holstein dairy cows were fed a feed ration comparable in dietary P (0.37% in dry matter) and crude protein (14% in dry matter) content, both located in the lower range of recommendations by NRC (National Research Council; Nutrient requirements of dairy cattle, 2001). After a three-week feed adaptation in a loose housing system we implied a 4-day P- and N balance study in tie-stalls. Cows were retrospectively grouped into a high (40%; n = 10) and a low Peff (33%; n = 10) group according to the results obtained from the P balance study. Finally, dairy cows were slaughtered to obtain tissue samples from jejunal mucosa, renal cortex and mammary gland with subsequently analyzing the expression of P transport proteins encoding mRNA by quantitative real-time PCR. Initially, our work revealed Peff and milk P yield to be strongly related to milk fat and milk protein yield. High Peff cows had an enhanced renal P reabsorption rate compared to low Peff cows, which was associated with reduced urinary P losses. The latter was paralleled by an upregulation of inorganic P transport protein -2 expression in renal tissue suggesting to be decisively involved in affecting individual differences in urinary P excretion. However, with respect to the much greater fecal P excretion, differences in urinary P excretion seem to be negligible. High Peff cows had a lower P apparent digestibility and a more negative P balance than low Peff cows, which has been attributed to a higher mobilization of body P reserves. Thus, taking the given results, in the presence of an insufficient P supply microbial protein synthesis in the rumen and related milk synthesis seem to be prioritized in expense of body P reserves. Beyond that, we found high Peff cows to excrete more fecal P relative to P ingested than low Peff cows compromising initial ecological benefits of a high Peff. In conclusion, results suggest reducing dietary crude protein supply rather than a selectively breeding for low MUN concentration to have a significant potential on mitigating N emissions deriving from cattle husbandry. In contrast, a selective breeding for high Peff and associated Neff was shown to be ecologically and economically reasonable. However, an insufficient dietary P supply stimulated the mobilization of body P reserves. A long-term mobilization of P reserves may negatively affect animal health and longevity and intensifies fecal P load. Thus, selective breeding for high Peff is reasonable, but dietary P supply should be geared towards the respective milk P yield and should be frequently verified by fecal P load within herd.

Die Rinderhaltung ist eine der Hauptquellen für anthropogene Stickstoff (N) und Phosphor (P) -Verluste, die sich negativ auf die Gesundheit von Mensch, Tier und Umwelt auswirken. Vor allem angesichts einer wachsenden Weltbevölkerung und schwindender globaler Ressourcen besteht daher die Notwendigkeit, ganzheitliche Ansätze zur Emissionsminderung zu entwickeln, die gleichzeitig einen nachhaltigen und effizienten Umgang mit den verfügbaren Ressourcen fördern. Erste Versuche zur Emissionsminderung konzentrierten sich zunächst auf Ernährungsstrategien wie die Reduzierung des N- und P-Gehalts im Futter bei gleichbleibendem Energieniveau, um die Nutzungseffizienz des aufgenommenen N und P für die Milchproduktion bei Milchkühen zu verbessern. Es hat sich gezeigt, dass die Milchharnstoff-N (MUN)-Konzentration linear mit den Urinharnstoffausscheidungen korreliert, was eine Vorhersage der N-Emissionen mit dem Urin und die Bewertung der diätetischen N-Versorgung ermöglicht. Es wurde angenommen, dass eine höhere P-Nutzungseffizienz (Peff), definiert als das Verhältnis zwischen der P-Sekretion in der Milch und dem aufgenommenen P, die fäkale P-Last bei Milchkühen verringert, da mehr P in die Milch geleitet wird. Bisher scheinen die Unterschiede in der MUN-Konzentration und in der Peff das Ergebnis eines kombinierten Effekts zwischen der genetischen Ausstattung der Tiere und der Futterzusammensetzung zu sein. Die selektive Zucht auf Milchkühe mit niedriger MUN Konzentration und hoher Peff könnte also dazu beitragen, die N- und P-Last im Urin und im Kot zu verringern und eine nachhaltigere Milchwirtschaft zu fördern. Ein erheblicher Teil der interindividuellen Schwankungen der MUN-Konzentration und der Peff sowie die zugrundeliegenden physiologischen Mechanismen sind jedoch weitgehend unbekannt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, physiologische und molekulare Mechanismen aufzuklären, die die interindividuelle Variation der MUN-Konzentration und der Peff bei laktierenden Holstein Milchkühen beeinflussen. Die Ergebnisse sollen dazu beitragen, das Potenzial einer selektiven Zucht auf MUN-Konzentration und Peff zu bewerten und gleichzeitig Fütterungsstrategien zu entwickeln, um den N- und P-Fußabdruck der Rinderhaltung in der Umwelt zu verringern. Die erste Studie hatte zum Ziel, physiologische Mechanismen, die an der Regulierung des Harnstoffmetabolismus und der damit verbundenen N-Ausscheidungen bei Milchkühen mit unterschiedlichen MUN-Konzentrationen beteiligt sind, aufzuklären. Zu diesem Zweck wurden 20 deutsche Holstein-Milchkühe paarweise gekauft, wobei eine Kuh eine hohe (277 mg/L; n = 10) und das Partnertier eine niedrige (189 mg/L; n = 10) MUN-Konzentration aufwies, aber hinsichtlich Laktationsdauer, Körpergewicht und Milchproduktion vergleichbar waren. Nach dem Transport in den Stall des Forschungsinstituts für Nutztierbiologie (FBN, Dummerstorf, Deutschland) wurden die Kühen auf zwei unterschiedlichen Rohproteinniveaus gefüttert (13,8% vs. 15,9% in der Trockenmasse). Nach einer zweiwöchigen Futteradaptationsperiode in einem offenen Laufstallsystem führten wir eine zweitägige indirekte Kalorimetrie und anschließend eine viertägige N-Bilanz- inklusive einer 13C-Harnstoff-Isotopen-Tracer-Studie durch. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die MUN-Gruppen sich weder in den N-Ausscheidungen im Kot noch in den Harnstoff- oder N-Ausscheidungen im Urin unterschieden, obwohl sie das gleiche Futter erhielten. Die letztgenannten Ergebnisse wurden auf eine unterschiedliche Nierenleistung in Bezug auf die allgemeine glomeruläre Filtrationsrate der Nieren und insbesondere auf die renale Clearance-Rate von Harnstoff zurückgeführt. Interessanterweise schieden Kühe mit hoher MUN-Konzentration unabhängig von der Eiweißfütterung weniger Kreatin und bei eiweißarmer Ernährung weniger Harnsäure mit dem Urin aus als Kühe mit niedriger MUN-Konzentration. Da jedoch 75% des gesamten N im Urin auf Harnstoff entfallen und sich die MUN-Gruppen in der Gesamt-N-Ausscheidung mit dem Urin nicht unterschieden, kamen wir zu dem Schluss, dass sich Kühe mit hohem und niedrigem MUN-Gehalt in Bezug auf die potentiellen Lachgas- oder Ammoniakemissionen nicht unterscheiden. Im Gegensatz dazu führte eine Verringerung des diätetischen Rohproteingehalts zu einer beträchtlichen Verringerung der N-Ausscheidungen im Urin bei gleichzeitiger Verbesserung der N-Nutzungseffizienz für die Milchproduktion. Die zweite Studie zielte darauf ab, die zugrunde liegenden physiologischen und molekularen Mechanismen aufzuklären, die die P- und N-Ausscheidungen von Milchkühen mit unterschiedlicher Peff beeinflussen. Zu diesem Zweck wurden 20 deutsche Holstein Milchkühe mit einer Futterration gefüttert, die einen vergleichbaren Gehalt an P (0,37% in der Trockenmasse) und Rohprotein (14% in der Trockenmasse) aufwies. Beide Gehalte liegen im unteren Bereich der NRC-Empfehlungen (National Research Council; Nutrient requirements of dairy cattle, 2001). Nach einer dreiwöchigen Futteradaptation in einem offenen Laufstallsystem führten wir eine 4-tägige P- und N-Bilanzstudie in Anbindung durch. Die Kühe wurden entsprechend den Ergebnissen der P-Bilanzstudie nachträglich in eine Gruppe mit hoher (40%; n = 10) und niedriger Peff (33%; n = 10) eingeteilt. Schließlich wurden die Milchkühe geschlachtet, um Gewebeproben aus der Jejunalschleimhaut, der Nierenrinde und der Milchdrüse zu gewinnen und anschließend die Expression der für P-Transportproteine kodierenden mRNA mittels quantitativer Echtzeit-PCR zu analysieren. Unsere Resultate zeigten, dass Peff und der P-Ertrag in der Milch stark mit dem Milchfett- und dem Milcheiweißertrag zusammenhängen. Kühe mit hoher Peff wiesen im Vergleich zu Kühen mit niedriger Peff eine höhere renale P-Rückresorptionsrate auf, was mit geringeren P-Verlusten im Urin einherging. Letzteres ging mit einer vergrößerten Expression des anorganischen P-Transportproteins-2 im Nierengewebe einher, was darauf hindeutet, dass es maßgeblich an den individuellen Unterschieden in der P-Ausscheidung im Urin beteiligt ist. Im Hinblick auf die viel größere fäkale P-Ausscheidung scheinen die Unterschiede in der P-Ausscheidung im Urin jedoch vernachlässigbar zu sein. Kühe mit hoher Peff hatten eine niedrigere scheinbare P Verdaulichkeit und eine negativere P-Bilanz als Kühe mit niedriger Peff, was auf eine höhere Mobilisierung der körpereigenen P-Reserven zurückgeführt wurde. Anhand der vorliegenden Ergebnisse lässt sich vermuten, dass bei unzureichender P-Versorgung die mikrobielle Proteinsynthese im Pansen und die damit verbundene Milchsynthese auf Kosten der Körper-P-Reserven priorisiert wird. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass Kühe mit hoher Peff im Verhältnis zum aufgenommenen P mehr P mit dem Kot ausscheiden als Kühe mit niedriger Peff, was die anfänglichen ökologischen Vorteile einer hohen Peff beeinträchtigt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse darauf hindeuten, dass eine Verringerung der diätetischen Rohproteinzufuhr ein erhebliches Potenzial zur Verringerung der N-Emissionen aus der Rinderhaltung hat, wohingegen eine Selektion auf niedrige MUN-Konzentrationen kaum Beiträge leisten kann. Im Gegensatz dazu erwies sich eine etwaige Zucht auf Kühe mit hoher Peff und einhergehender Neff als ökologisch und wirtschaftlich sinnvoll. Eine unzureichende diätetische P-Versorgung stimuliert jedoch die Mobilisierung der körpereigenen P-Reserven. Eine langfristige Mobilisierung von P-Reserven kann sich negativ auf die Gesundheit und Langlebigkeit der Tiere auswirken und erhöht die P-Last im Kot. Daher ist eine selektive Zucht auf eine hohe Peff sinnvoll, aber die P-Versorgung mit dem Futter sollte sich an der jeweiligen Milch-P-Leistung orientieren und regelmäßig anhand der fäkalen P-Last innerhalb der Herde überprüft werden.