Modulation of polycyclic aromatic hydrocarbon toxicity by the human skin microbiome

Abstract

With approximately 2 m2 the human skin is one of our largest organs and serves as the primary barrier against the external environment. As such, it is subject to environmental impacts and xenobiotic exposures. These include polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH). Their ubiquitous occurrence results in constant human exposure, with many PAHs being suspected or established carcinogens. The best characterized model substance is benzo[a]pyrene (B[a]P) which is metabolized by eukaryotic cytochrome P450 dependent monooxygenases (CYPs) to form the highly mutagenic B[a]P-7,8-diol-9,10-epoxide (BPDE). Being environmental and industrial contaminants PAHs are predominantly addressed either for their environmental or toxicological fate. This includes their potential toxification and metabolism in eukaryotes as well as their microbial degradation in the environment. Yet, the latter is often driven by the PAHs potential to serve as a source of carbon and energy for microbial growth. With a plethora of underlying pathways this is as such of course also relevant for the human microbiome and the question of potential microbiome-mediated substance toxification. In preliminary work at the German Federal Institute for Risk Assessment (BfR), it could be shown that PAH-metabolism is indeed a ubiquitous feature of the human skin microbiome. Using batch enrichment and skin swabs from 11 volunteers a total of 21 pure cultures were isolated, all of which used B[a]P as their sole source of carbon and energy. Building on these results this thesis subsequently investigated the respective microbial PAH-metabolism and –toxification in vitro as well as assessing the potential host-impact and related microbiome-host interactions in situ. To address these questions in more detail a total of 4 skin isolates were examined further. These included two representatives of M. luteus, one B. licheniformis and one P. oleovorans, respectively. Using carbon-limited cultures, we could show that these skin commensals convert B[a]P into a number of highly cyto- and genotoxic metabolites that are excreted in toxicologically relevant concentrations during growth. The respective bacterial supernatants contained a mixture of eukaryotic and prokaryotic metabolites, the combination of which led to synergistic cyto- and genotoxicity at levels clearly exceeding of what was induced by either the substances alone or a mixture thereof, respectively. In order to assess the potential impact of this commensally triggered toxification on the human host we established a microbial competent skin tissue co-culture system. Being the first of its kind to investigate microbial substance toxification and its longer term effects on the skin and its commensals in a highly standardized manner under near in vivo conditions the prototype of this model consisted of MatTek's 3-D skin model EpidermFT™ colonized with M. luteus, P. oleovorans or a mixture thereof. The model was shown to maintain stable colony counts for prolonged periods of time, allowing the reliable study of substance induced microbe-host effects. It could be shown that microbe-host interaction as such resulted in strong changes in the skin with regard to CYP-expression, microbiota-related expression of immunomodulatory domains, as well as cell growth, cell proliferation and skin differentiation. Altogether these and further results suggest commensal colonization to induce strengthening of the epidermal barrier. Application of B[a]P to commensally colonized models led to the formation and accumulation of B[a]P-metabolites on the skin. The metabolites matched those previously identified in the respective carbon limited batch cultures with the most predominant one being the genotoxic B[a]P-7,8-dione. However, notably unmetabolized B[a]P as well as its metabolites penetrated the skin layers of the commensally competent models to a lesser extent due to a microbial- induced strengthening of tight junctions (TJ) and increased epidermal differentiation. Most importantly, the formation and penetration of the ultimate carcinogen BPDE was greatly reduced in the colonized models, which consequently led to lower formation of BPDE-DNA adducts. Altogether the results demonstrate that albeit there is a high potential for microbial-induced PAH-toxification, further assessment of its respective effects on host biology and wellbeing requires complex model systems. Given the high species specificity of microbiomes any such systems have to be sufficiently species relevant as to avoid false predictions. Only few such systems exist with those available predominantly covering the gut. For skin this thesis is the first work that established a standardized and widely applicable commensal 3D-skin co-culture model to study microbiome-induced substance toxicity, using PAH as a proof of concept.

Die menschliche Haut ist mit ca. 2 m2 eines unserer größten Organe und dient als primäre Barriere gegenüber unserer Außenwelt. Als solche ist sie Umwelteinflüssen sowie Xenobiotika direkt ausgesetzt. Zu Letzteren gehören polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK), deren ubiquitäres Vorkommen zu einer konstanten Exposition des Menschen führt und von denen viele potentielle oder bestätigte Kanzerogene sind. Die am besten charakterisierte Modellsubstanz ist Benzo[a]pyren (B[a]P), das von eukaryotischen Cytochrom P450-abhängigen Monooxygenasen (CYPs) zu dem stark mutagenen B[a]P-7,8-diol-9,10-epoxid (BPDE) metabolisiert wird. Als Umwelt- und Industriekontaminanten werden PAKs überwiegend entweder auf ihr Umwelt- oder ihr toxikologisches Verhalten hin untersucht. Dies umfasst sowohl ihre potentielle Toxifizierung und ihren Metabolismus in Eukaryoten als auch ihren mikrobiellen Abbau in der Umwelt. Letzteres wird oft durch das Potenzial der PAKs, als Kohlenstoff- und Energiequelle für mikrobielles Wachstum zu dienen, angetrieben. Mit einer Fülle von zugrundeliegenden Stoffwechselwegen ist dies natürlich auch für das menschliche Mikrobiom und die Frage nach einer möglichen Mikrobiom-vermittelten Substanztoxifizierung relevant. In Vorarbeiten am Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR) konnte gezeigt werden, dass der PAK-Metabolismus tatsächlich ein ubiquitäres Merkmal des menschlichen Hautmikrobioms darstellt. Mittels Batch-Anreicherung und Hautabstrichen von 11 Probanden wurden insgesamt 21 Reinkulturen isoliert, die B[a]P als alleinige Kohlenstoff- und Energiequelle nutzen können. Aufbauend auf diesen Ergebnissen untersuchte diese Arbeit den jeweiligen mikrobiellen PAK-Metabolismus und die Toxifizierung in vitro sowie die potenzielle Auswirkung auf den Wirt und die damit verbundenen Mikrobiom-Wirt-Interaktionen in situ. Um diese Fragestellungen zu klären wurden vier repräsentative Hautisolate weiterführend toxikologisch untersucht. Darunter waren zwei Vertreter von M. luteus, ein B. licheniformis und ein P. oleovorans. Mit Hilfe von kohlenstofflimitierten Kulturen konnten gezeigt werden, dass diese Hautkommensalen B[a]P in eine Reihe hochzyto- und genotoxischer Metaboliten umwandeln, die während des Wachstums in toxikologisch relevanten Konzentrationen ausgeschieden werden. Die jeweiligen bakteriellen Überstände enthielten ein Gemisch aus eukaryotischen und prokaryotischen Metaboliten, deren Kombination zu einer synergistischen Zyto- und Genotoxizität führte, die deutlich über derjenigen lag, die durch die Substanzen allein bzw. deren Gemisch induziert wurde. Um die potentiellen Auswirkungen dieser kommensal-induzierten Toxizität auf den menschlichen Wirt zu untersuchen, haben wir eine mikrobiell kompetente Hautgewebe-Co-kultur etabliert. Als eines der ersten seiner Art, um längerfristige Effekte des menschlichen Hautmikrobioms in einer hoch standardisierten Weise unter nahezu in vivo Bedingungen zu untersuchen, bestand der Prototyp dieses Modells aus MatTek's 3-D-Hautmodell EpidermFT™, besiedelt jeweils mit M. luteus, P. oleovorans oder einem Gemisch aus beiden Organismen. Es wurde gezeigt, dass das Modell über längere Zeiträume stabile Koloniezahlen aufrechterhält, was die zuverlässige Untersuchung von substanzinduzierten Mikroben-Wirt-Effekten ermöglicht. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Mikroben-Wirt-Interaktion als solche zu starken Veränderungen in der Haut hinsichtlich der CYP-Expression, der mikrobiotabezogenen Expression immunmodulatorischer Domänen sowie des Zellwachstums, der Zellproliferation und der Hautdifferenzierung führte. Insgesamt deuten diese und weitere Ergebnisse auf eine kommensal bedingte Stärkung der epidermalen Barriere hin. Die Applikation von B[a]P auf die kommensal besiedelten Modelle führte zur Bildung und Akkumulation von B[a]P-Metaboliten auf der Hautoberfläche. Die Metaboliten stimmten mit denen überein, die zuvor in den jeweiligen kohlenstofflimitierten Batch-Kulturen identifiziert worden waren, wobei das genotoxische B[a]P-7,8-Dion vorherrschte. Allerdings drangen vor allem das unmetabolisierte B[a]P sowie dessen Metaboliten nur in geringerem Maße in die Hautschichten der kommensal kompetenten Modelle ein, was auf eine mikrobiell induzierte Stärkung der Tight Junctions (TJ) und eine erhöhte epidermale Differenzierung zurückzuführen ist. Besonders bedeutsam war die stark verminderte Bildung und Penetration des ultimativen Karzinogens BPDE was in der Konsequenz zu einer geringeren Bildung von BPDE-DNA-Addukten führte. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass es zwar ein hohes Potenzial für eine mikrobiell-induzierte PAK-Toxifizierung gibt, die weitere Bewertung der jeweiligen Auswirkungen auf die Wirtsbiologie und –Gesundheit jedoch komplexe Modellsysteme erfordert. Angesichts der hohen Speziesspezifität von Mikrobiomen müssen solche Systeme ausreichend speziesrelevant sein, um falsche Vorhersagen zu vermeiden. Es existieren nur wenige solcher Systeme, wobei die vorhandenen vorwiegend den Darm abdecken. Für die Haut ist diese Doktorarbeit die erste Studie, die ein standardisiertes und breit anwendbares kommensales 3D-Haut-Kokulturmodell zur Untersuchung der Mikrobiom-induzierten Substanztoxizität etabliert hat, wobei PAKs für den „Proof of Concept“ verwendet wurden.