Untersuchungen zum mTOR-Signalweg in humanen Kontroll- und Hutchinson-Gilford-Progerie-Fibroblasten

Abstract

Altern ist ein Prozess, der sich durch einen Verlust der Funktionen des Körpers, der Organe und der Zellen mit zunehmender Lebenszeit äußert und früher oder später zum Tod der meisten lebenden Organismen führt. Beschleunigt wird das Altern durch verschiedene Faktoren, wie oxidativer Stress, energiereiche Strahlung, Lebensgewohnheiten oder genetische Defekte. Zu den genetischen Erkrankungen gehört die Hutchinson-Gilford-Progerie (HGP), eine monogenetische Erkrankung, die sich durch verfrüht einsetzende und beschleunigte Alterung auszeichnet. Als möglicher therapeutischer Ansatz sowohl bei der Progerie als auch beim normalen Alternsprozess wird das machanistic Target of Rapamycin (mTOR) und dessen Signalweg untersucht. Der mTOR-Signalweg ist in die Regulation von wichtigen Stoffwechselprozessen und die Regulation von Zellwachstum involviert. Dabei ist dessen Rolle bei Alterungsprozessen und bei der Pathogenese der Progerie nur unzureichend geklärt. Der mTOR-Signalweg wurde auf Proteinebene mittels Western-Blot-Analyse semi-quantitativ analysiert. Dazu wurden das up-stream-Protein Akt, mTOR selbst und die down-stream-Proteine p70S6K und ULK1 betrachtet. Als zelluläres Modell wurden Kontroll- und HGP-Fibroblastenkulturen so lange vermehrt, bis sie durch zunehmende Telomerverkürzung das Stadium der replikativen Seneszenz erreichten. Der Einfluss der Telomerlänge wurde durch den Vergleich von Zellen mit kurzen und langen Telomeren (nach Immortalisierung mit humaner Telomerase Reverse Trankriptase (hTERT)) untersucht. Wasserstoffperoxid diente als nicht-replikativer Stressor. Es wurde gezeigt, dass bei HGP-Fibroblasten eine um ca. 53% (±35%) beschleunigte Proliferationsrate vorlag sowie ein frühzeitiger Wachstumsstopp (im Mittel 226 Tage eher) bei gleichzeitig erhöhtem Anteil an seneszenten Zellen (HGP 73 ±18% vs. CON 40±3%) zu verzeichnen war. Während in gesunden, replikativ gealterten Zellen mit geringerer Proliferation die genannten Schlüsselproteine des mTOR-Signalweges um mindestens 50% supprimiert waren, konnte in gealterten Progerie-Zellen mit Ausnahme von p70S6K eine verstärkte Proteinexpression des mTOR-Signalweges gezeigt werden. Die Immortalisierung mit hTERT, verbunden mit einer Telomerverlängerung, wirkte den Effekten des replikativen Alterns sowohl in Kontrollzellen als auch in den Progerie-Zellen in unterschiedlichem Ausmaß entgegen. Wasserstoffperoxid hatte keinen signifikanten Effekt auf den mTOR-Signalweg und konnte die Effekte des replikativen Alterns nicht imitieren. Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse bei Progerie-Zellen, dass eine verstärkte Proliferation mit einer veränderten Aktivierung des mTOR-Signalweges als ein möglicher Pathomechanimus der verstärkten Alterungsprozesse diskutiert werden kann.

Aging is a process in almost all living organisms, which is defined by an increased loss of function over time on different levels and is finally leading to death. Aging is accelerated by various factors such as oxidative stress, high-energy radiation, lifestyle and genetic defects. Hutchinson-Gilford-Progeria (HGP) is a monogenetic disease which is characterized by premature and accelerated aging and represents an important model because many aspects are also observed in normal aging. One therapeutical target of normal aging and HGP is the mechanistic target of rapamycin (mTOR) and its signaling pathway. It regulates important metabolic processes and is involved in cell growth and metabolism. Its specific role in aging and in the pathogenesis of HGP is only partially known. Here, the mTOR signaling pathway was investigated by using semi-quantitative Western-blot-analysis of up-stream-protein Akt, mTOR, and down-stream proteins p70S6K and ULK1. Control- and HGP-fibroblasts were grown until they reached replicative senescence through progressive shortening of telomeres. The effects of telomere length were examined by comparing cells with short telomeres and cells with long telomeres after immortalization with human telomerase reverse transcriptase (hTERT). Hydrogen peroxide served as a non-replicative stressor. HGP-fibroblasts revealed an increased proliferation rate by 53% (±35%) and a premature entry into arrest (on average 226 days earlier) with a higher percentage of senescent cells (HGP 73 ±18% vs. CON 40±3%). Healthy, replicatively aged cells exhibit lower proliferation rates, while key proteins of the mTOR signaling pathway were suppressed by at least 50%. HGP cells showed an impaired reduction of the mTOR pathway except for p70S6K. Immortalization, accompanied by telomere elongation, counteracted the effects of aging in both groups to varying extents. Treatment with hydrogen peroxide showed no significant effects on the mTOR pathway and could not imitate replicative aging. The results suggest that increased proliferation rates and impaired mTOR-signaling could be a pathogenetic mechanism of accelerated aging in progeria.