Inhibitorische und exzitatorische Neurone des Colliculus inferior der Maus: Ih-Ströme und erregende Eingänge

Abstract

Akustische Informationen werden in den Hirnstammnuklei der Hörbahn verarbeitet und konvergieren auf ihrem Weg zum auditorischen Cortex in dem Colliculus inferior (IC, engl.) des Mittelhirns, insbesondere in seinem zentralen Nukleus (CIC). Der CIC stellt ein Relais dar, in dem neben bilateralen aufsteigenden Projektionen auch kommissurale, intrinsische und von höheren Gehirnregionen absteigende Projektionen verarbeitet werden. Trotz der bedeutenden Rolle des IC bei der neuronalen Verarbeitung der akustischen Signale sind die unterschiedlichen Neuronentypen sowie, deren Verschaltungen noch nicht ausreichend charakterisiert. In dieser Arbeit wurden die inhibitorischen (GABAergen) und exzitatorischen (glutamatergen) CIC-Neurone hinsichtlich ihrer Membraneigenschaften – Ih-Ströme und erregende Eingänge – mittels elektrophysiologischer Experimente an Gehirnschnitten, sowie immunhistochemischen (IHC-) Färbungen in jungen adulten Mäusen (postnatales Alter über 22 Tage) verglichen. Für diese Experimente wurde der transgene Mausstamm VGAT-ChR2- EYFP Linie 8 verwendet. Dieser Mausstamm exprimiert unter dem Promotor für den vesikulären GABA/Glycin Transporter (VGAT) enhanced yellow flourescent protein (EYFP) und channelrhodopsin 2 (ChR2), wodurch es möglich ist GABAerge und nicht-GABAerge (glutamaterge) Neurone visuell und anhand ihrer Reaktion auf optogenetische Stimulation zu unterscheiden. Die HCN-Kanäle (hyperpolarization-activated and cyclic nucleotide-gated channel, engl.) bzw. deren physiologische Korrelat – hyperpolarisations-aktivierende Strom (Ih, engl.) tragen zur Integration der synaptischen Eingänge in der aufsteigenden Hörbahn bei, ihr Vorkommen im IC wurde bereits gezeigt. Die Fragen, ob die Expression verschiedener HCN-Isoformen (HCN1, 2 und 4), Ih-Ströme, sowie Antworten der Neurone auf die hyper- und depolarisierenden Strominjektionen spezifisch für GABAerge und glutamaterge Neurone im IC sind, blieb bisher unbeantwortet. Messungen der pharmakologisch isolierten Ih-Ströme zeigten, dass alle GABAergen Neurone der Stichprobe langsam-aktivierende Ih-Ströme mit mittleren Amplituden aufweisen. Die glutamatergen Neurone waren stattdessen variabel in ihren Ih-Eigenschaften, dabei zeigte ein Teil der Neurone schnell-aktivierende Ih-Ströme mit hohen Amplituden. Die positive Immunreaktivität (IR) für die schnell-aktivierenden HCN1- in den Zellmembranen von exzitatorischen Neuronen und positive IR für die langsam- aktivierenden HCN4-Kanäle um die Somata der inhibitorischen Neurone unterstützen diese Funde. Beide Neuronengruppen waren positiv für die HCN2-IR. Des Weiteren wurden die Eigenschaften der Ih-Ströme und Neurotransmitterphänotyp mit dem Aktionspotential-(AP)-Feuermuster, das mittels depolarisierender Strominjektionen gemessen wurde, korreliert. Alle GABAergen Neurone zeigten ein adaptierendes AP-Feuermuster, das ähnlich dem der meisten glutamatergen Neurone war. Glutamaterge Neurone zeigten zu ca. 15% Onset- AP-Feuermuster, das immer in Kombination mit dem schnell aktivierenden und in seiner Amplitude großen Ih-Strom auftrat. Diese Ergebnisse zeigen, dass die HCN-Kanäle 1 und 4 zwischen den Neuronentypen im CIC unterschiedlich verteilt sind und dass sie mit dem Neurotransmitterphänotyp und AP-Feuermuster korrelieren. Im Kontrast zu anderen Gehirnregionen ähnelten im CIC die GABAergen Neurone ca. zu einem Drittel der glutamatergen Neurone hinsichtlich ihrer Membraneigenschaften und AP-Feuermuster. Die restlichen glutamatergen Neurone konnten hinsichtlich ihrer Ih-Eigenschaften und AP-Feuermuster in mindestens drei weiteren Populationen aufgeteilt werden. Die Glutamatrezeptoren aus der Gruppe der AMPA-Rezeptoren (GluR), u.a. die Rezeptoren mit der Untereinheit 4 (GluR4-UE), die schnelle Kinetik aufweist, sind für die zeitlich genaue Signalübertragung im auditorischen System bedeutend. Somit wurde (a) die Expression der GluR4-UE und des vesikulären Glutamattransporters 2 (VGluT2), (b) die Eigenschaften der exzitatorischen postsynaptischen Ströme (EPSCs, engl.) und (c) die mögliche Verschaltung der aufsteigenden glutamatergen Projektionen, über den Lemniscus lateralis (LL), zum IC mit dem Neurotransmitterphänotyp der CIC-Neurone korreliert. Die IHC-Färbung gegen die GluR4-UE zeigte, dass die meisten GABAergen Neurone der Stichprobe diese exprimieren, während die glutamatergen Neurone keine GluR4-IR aufwiesen. Elektrophysiologische Messungen der miniatur EPSCs (mEPSCs) und der EPSCs, die durch die elektrische Stimulation der Axonen im LL in CIC-Neuronen evoziert wurden, unterstützen diese Ergebnisse, da die Kinetik der (m)EPSCs bei den meisten GABAergen Neuronen deutlich schneller als bei den glutamatergen Neuronen war. Ferner war die Latenz der durch LL-Stimulation evozierten EPSCs und APs bei den GABAergen Neuronen fast doppelt so lang und viel variabler wie bei den glutamatergen Neuronen. Dies könnte auf eine Verschaltung über mehr als eine Synapse hindeuten, bzw. dass die Erregung aus dem LL über feed-forward (engl.) Verschaltung zu einem AP bei den GABAergen Neuronen führt. Glutamaterge Neurone werden stattdessen vermutlich über die direkten Eingänge aus dem LL angeregt. Die IHC-Färbung gegen VGluT2 zeigte, dass ca. 2/3 der GABAergen CIC-Neurone von somatischen VGluT2-positiven Synapsen umgeben sind. Konsistent dazu wurde gezeigt, dass die Mehrheit der GABAergen Neurone, die nach den elektrophysiologischen Experimenten auf die VGluT2-Expression in perisomatischen Eingängen verifiziert wurden, EPSCs mit schneller Kinetik und langer Latenz aufwiesen. Dies deutet darauf hin, dass diese Population der GABAergen CIC-Neurone ein mögliches Ziel der schnellen GluR4-vermittelten feed-forward Erregung aus dem LL sein könnten. Die Expression der schnellen GluR4-Rezeptoren und die Präsenz vieler VGluT2-positiver somatischer Synapsen korrelieren vermutlich bei einer großen Population der GABAergen Neurone mit der Expression der langsam aktivierenden HCN4-Kanäle und heben somit diese Neuronengruppe von den, in ihren Membraneigenschaften variablen glutamatergen CIC-Neuronen ab. Die HCN4-Kanäle könnten die Summation, der an diesen GABAergen Neuronen konvergierenden erregenden aufsteigenden Eingänge begünstigen und somit zur Verarbeitung der Schallinformationen im IC beitragen.

Acoustic information is processed in brainstem nuclei of the auditory pathway and converges on its way to the auditory cortex in the inferior colliculus (IC) in the midbrain, especially in its central nucleus (CIC). CIC represents a relay in which bilateral ascending projections as well as commissural, intrinsic, and descending projections from higher brain regions are processed. Despite the important role of IC in neuronal processing of acoustic signals, the different neuron-types as well as their circuitry have not yet been sufficiently characterized. Herewith, inhibitory (GABAergic) and excitatory (glutamatergic) CIC neurons were compared with respect to their membrane properties – Ih currents and excitatory inputs by means of electrophysiological experiments on brain slices and immunohistochemical (IHC) stainings in young adult mice (older than postnatal day 22). An optogenetic approach in transgenic mouse strain VGAT-ChR2-EYFP line 8, in which enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) and channel rhodopsin 2 (ChR2) are expressed under the promoter for vesicular GABA/glycine transporter (VGAT), allowed to distinguish GABAergic and non-GABAergic (glutamatergic) neurons. The hyperpolarization-activated and cyclic nucleotide-gated channels (HCN) or their physiological correlate – hyperpolarization-activating current (Ih) contribute to the integration of synaptic inputs in the ascending auditory pathway and have already been shown in IC. Whether expression of HCN isoforms (HCN1, 2 and 4), Ih currents as well as responses of neurons to hyperpolarizing and depolarizing current injections are neurotransmitter specific in IC remained open. Measurements of pharmacologically isolated Ih-currents show that all GABAergic neurons in the sample showed slow-activating Ih currents with intermediate amplitudes. Instead, the glutamatergic neurons were variable in their Ih properties, with a proportion of neurons showing fast-activating Ih currents with high amplitudes. Positive immunoreactivity (IR) for the fast-activating HCN1 channels in the cell membranes of excitatory neurons and positive IR for the slow-activating HCN4 channels around the somas of inhibitory neurons support these findings. Both groups of neurons show IR for HCN2. Furthermore, properties of Ih currents and neurotransmitter phenotype were correlated with action potential firing patterns measured by depolarizing current injections. All GABAergic neurons showed adapting firing patterns, which was similar in most glutamatergic neurons. Glutamatergic neurons showed to about 15% onset AP firing pattern which always occurred in combination with the fast-activating Ih current with large amplitude. These results indicate that HCN channels 1 and 4 are differentially distributed among neuron types in CIC and that they correlate with the neurotransmitter phenotype and firing pattern. In contrast to other brain regions, GABAergic neurons in CIC resembled approximately one-third of glutamatergic neurons in terms of their membrane properties and firing patterns. The remaining glutamatergic neurons could be divided into at least three other populations according to their Ih and firing patterns. Glutamate receptors from the group of AMPA receptors (GluR), including the fast kinetics receptor subunit 4 (GluR4), are important for temporally accurate signal transmission in the auditory system. Thus, (a) expression of GluR4 and vesicular glutamate transporter 2 (VGluT2), (b) properties of excitatory post synaptic currents (EPSCs) as well as (c) putative wiring of the ascending glutamatergic Projections via lateral lemniscus (LL) to IC was correlated with the neurotransmitter phenotype of CIC neurons. IHC staining against the GluR4 showed that most of the GABAergic neurons in the sample expressed it, whereas the glutamatergic neurons did not exhibit GluR4-IR. Electrophysiological recordings in CIC of miniature EPSCs (mEPSCs) and EPSCs, which were electrically evoked via stimulation of Axons in LL, support these findings. Most GABAergic neurons showed significantly faster EPSC-kinetic than glutamatergic neurons. Furthermore, the latency of evoked EPSCs and action potentials was almost twice so long in GABAergic neurons and much more variable as in glutamatergic neurons. This could indicate circuitry with more than one synapse, or rather that excitation from the LL leads to an AP in GABAergic neurons via feed-forward circuitry. In contrary, glutamatergic neurons are likely excited via direct inputs from the LL. IHC staining against VGluT2 showed that approximately 2/3 of GABAergic CIC neurons are surrounded by somatic VGluT2-positive synapses. Consistently, most GABAergic neurons verified for VGluT2 expression in somatic synapses were shown to exhibit EPSCs with fast kinetics and long latency. This suggests that this population of GABAergic CIC neurons may be a possible target of fast GluR4-mediated feed-forward excitation from the LL. Expression of fast-kinetic GluR4 receptors and VGluT2 in somatic synapses presumably correlate in a large population of GABAergic neurons with the expression of the slow-activating HCN4 channels, thus distinguishing them from the glutamatergic CIC-neurons with their variable membrane properties. The HCN4 channels could favor the summation of ascending excitatory inputs, which converge in GABAergic neurons, thus contribute to the processing of sound information in IC.