The ability to dynamically observe functional processes at the (sub-) cellular level holds a high potential to answer open questions in medical biology, e.g. immunology. The ubiquitous co-enzymes nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and its phosphorized variant (NADPH) play a major role in metabolic processes, for instance in the production of the energy carrier ATP, or in the generation of reactive oxygen species (ROS) for cellular defense against invading pathogens. Since these two co-enzymes are autofluorescent, they provide an endogenous sensor to study those basic mechanisms label-free in vitro and in vivo using multi-photon microscopy. When NADH/NADPH bind to another enzyme to catalyze one of these processes, the molecular structure of the assembled enzyme compartment changes and thus (in contrast to their emission wavelengths) their fluorescence lifetime, meaning the time the molecule remains in the excited state before it emits light. However, the evaluation and interpretation of NAD(P)H fluorescence lifetime images (FLIM) in real biological environments are challenging. Here, the method of phasor analysis has been adopted and applied to stimulated/non-stimulated ROS-producing lymphocytes. This way it was possible to directly image the temporal dynamics of NADPH oxidase activation and its requirement for triggering NETosis in phagocyting neutrophils. In order to meet the growing demand for a systematic interpretation of NAD(P)H-FLIM measurements, especially to reflect the complex distribution and activity of NAD(P)H-dependent enzymes, the phasor approach was extended by the analysis of the phase vectors involved. For this purpose, a priori knowledge about the specific fluorescence lifetimes of the most abundant enzymes in tissue was created by measuring NADH or NADPH with the respective enzyme in solution. Applied to 3T3-L1 cell line or the data of phagocyting neutrophils, this method reveals insights into the enzyme composition and its enzymatic activity, which was shown to be even more complex than the pure FLIM images suggest. In addition to NAD(P)H-FLIM, the phasor approach and the vector analysis application to extract further information from the FLIM images was applied to Förster resonance energy transfer (FRET). The CD19+ lymphocytes of the reporter mouse line YellowCaB, carry the genetically encoded calcium-sensitive FRET-construct TN-XXL. In the presence of calcium ions, a second messenger of signal transduction, this construct is folded and the donor quenched. The fluorescence lifetime of the donor is shortened proportionally to the cytosolic Ca2+ concentration. Using vector analysis in the phase domain, maps of the absolute calcium ion concentration of the different B-cell populations in the germinal center of the lymph node were generated and their cell-to-cell interaction visualized. Together, both NAD(P)H-FLIM and donor-FRET-FLIM, hold the power to map mechanisms in cellular metabolism, defense, and intercellular communication, providing new insights into their interaction.
Funktionelle Prozesse auf (sub-) zellulärer Ebene dynamisch beobachten können, birgt ein hohes Potential ausstehende biomedizinische Fragestellungen z.B. der Immunologie beantworten zu können. Die ubiquitären Co-Enzyme Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NADH) und seine phosphorisierte Variante (NADPH) spielen eine wichtige Rolle bei Stoffwechselprozessen, zum Beispiel bei der Produktion des Energieträgers ATP oder bei der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) zur zellulären Abwehr eindringender Krankheitserreger. Da diese beiden Co-Enzyme autofluoreszierend sind, liefern sie einen endogenen Sensor, um diese grundlegenden Mechanismen markierungsfrei in vitro und in vivo mittels Multiphotonenmikroskopie zu untersuchen. Wenn sich diese Co-Enzyme an ein weiteres Enzym binden, um einen dieser Prozesse zu katalysieren, verändert sich der molekulare Aufbau des Gesamtkonstrukts und damit (im Gegensatz zu ihrer Emissionswellenlänge) die Fluoreszenzlebensdauer, also die Zeit, die das Moleküle im angeregten Zustand verweilt, bevor es fluoresziert. Allerdings ist seit langem bekannt, dass sowohl die Auswertung als auch die Interpretation einer solchen Lebenszeitmessung in einer realen biologischen Umgebung eine Herausforderung ist. In der vorliegenden Arbeit wurde die Methode der phasor-Analyse übernommen und auf stimulierte/ nicht-stimulierte ROS-produzierende Lymphozyten angewendet. Auf diese Weise war es möglich, die zeitliche Dynamik der NADPH-Oxidase-Aktivierung und ihre Voraussetzung für die Auslösung der NETosis in phagozytierenden Neutrophilen direkt abbilden. Um den wachsenden Bedarf einer systematischen Interpretation von NAD(P)H-Fluoreszenzlebenszeitaufnahmen zu begegnen, speziell um die komplexe Verteilung und Aktivität der NAD(P)H-abhängigen Enzymen wiedergeben zu können, wurde die phasor-Anwendung um eine Analyse der beteiligen Phasenvektoren erweitert. Zu diesem Zweck wurde durch die Messung von NADH oder NADPH mit dem jeweiligen Enzym in Lösung a priori Wissen über die spezifischen Fluoreszenzlebensdauern der am häufigsten im Gewebe vorkommenden Enzyme geschaffen. Angewendet auf die 3T3-L1 Zelllinie oder die Daten von phagozytierenden Neutrophilen, offenbart diese Methode Einblicke in die Enzymzusammensetzung und enzymatische Aktivität, die noch komplexer ist als die reinen FLIM-Bilder vermuten lassen. Neben NAD(P)H-FLIM kann die phasor-Anwendung und die Herangehensweise der Vektoranalyse zum Extrahieren weiterer Informationen aus den FLIM-Aufnahmen auch auf den Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) angewendet werden. Die CD19+ Lymphozyten der Reporter Mauslinie YellowCaB tragen genetisch kodiert das calciumsensitive FRET-Konstrukt TN-XXL. In Anwesenheit von Kalziumionen, einem sekundären Botenstoff der Signaltransduktion, wird das Konstrukt gefaltet und der donor gequenched, dessen Fluoreszenzlebensdauer sich proportional zur zytosolischen Ca2+ Konzentration verkürzt. Mit Hilfe der Vektoranalyse in der Phasenebene wurden hier Karten der absoluten Kalziumionenkonzentration verschiedener B-Zellpopulationen im Keimzentrum des Lymphknotens erstellt und auf diese Weise deren Zell-zu-Zell-Kommunikation sichtbar gemacht. Zusammen sind beide, NAD(P)H-FLIM und donor-FRET-FLIM, in der Lage, Mechanismen des Zellstoffwechsels, der zellulären Abwehr und der interzellulären Kommunikation abzubilden und eröffnen so neue Einblicke in deren Zusammenspiel.
