Introduction. Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common cancers worldwide and still lacks effective treatment for its advanced stages. While kinase inhibitors (KIs) have had first successes as systemic therapies, they only provide moderately improved prognosis compared to the best palliative care. Discovering more effective drugs – especially for targeted therapies – is a time-consuming and costly process. In recent decades, computational methods have therefore been increasingly integrated into drug research and development. The aim of this thesis was to determine the kinase inhibitory and anticancer effects of a panel of new potential tyrosine kinase inhibitors (thiophenes and bromobenzenes) using a combined in silico and in vitro approach. Methods. Three computational ligand- (SwissTargetPrediction) and structure-based (@TOME, iRAISE) target prediction methods were applied for the most promising thiophene (Thio-Iva). Correlated results (with additional targets relevant for HCC) were verified with a radiometric kinase activity assay (Eurofins KinaseProfilerTM). Docking studies (SeeSAR) were performed to investigate the binding mode and structure-activity relationship of all the novel compounds to Thio-Iva’s identified main target VEGFR2. Additional molecular dynamics simulations (Desmond) were performed for Thio-Iva to verify the binding hypothesis. Potential toxicities and ADME properties of Thio-Iva and the most promising bromobenzene Briva were investigated with predictive computational webservices (eMolTox, SwissADME). Cell culture experiments were performed with HCC cell lines (HepG2, Huh-7) to investigate Thio-Iva’s and Briva’s growth inhibitory effects (crystal violet assay), acute unspecific toxicity (LDH release measurement) and activation of apoptotic pathways (caspase-3 activity assay). Results and discussion. Six out of the 43 kinase targets selected for in vitro evaluation showed inhibition by Thio-Iva of over 50% (VEGFR1, VEGFR2, Pim-1, Pim-2, CLK1 and c-Kit). These results indicate some selectiveness, but most importantly the high inhibitory activity of Thio-Iva on VEGFR2 (89% at 10 µM) and VEGFR1 (75%). Docking studies with VEGFR2 showed a stable binding pose of Thio-Iva with a hydrogen bond at the important hinge region of VEGFR2. This pose stayed consistent over a molecular dynamics simulation of 100 ns, rationalizing the biological activity observed on this target. There were few predicted toxic properties of Thio-Iva and Briva, which was complemented by the low toxicity measured in the wet lab experiments. Cell culture experiments also showed pronounced growth inhibitory effects and the induction of apoptosis by the two compounds on HCC cells. Overall, these results indicate that Thio-Iva in particular could be a promising lead compound for VEGFR2/multikinase inhibitors with strong anticancer activity.
Einleitung. Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist eine der häufigsten Krebsformen weltweit, und es fehlt immer noch an effektiven Therapien für fortgeschrittene Stadien. Zwar konnten Kinase-Inhibitoren (KIs) erste Erfolge als systemische Therapien erzielen, jedoch bieten sie nur eine moderat verbesserte Prognose im Vergleich zur besten palliativen Versorgung. Die Suche nach effektiveren Medikamenten – insbesondere für zielgerichtete Therapien (Targeted Therapies) – ist ein zeitaufwändiger und kostspieliger Prozess. In den letzten Jahrzehnten wurden daher zunehmend computergestützte Methoden in die Arzneimittelforschung und -entwicklung integriert. Ziel dieser Arbeit war es, die kinaseinhibitorische und krebshemmende Wirkung eines Panels neuer potentieller Tyrosinkinase-Inhibitoren (Thiophene und Brombenzole) mit einem kombinierten Ansatz aus in silico und in vitro Methoden zu bestimmen. Methoden. Zur Target-Vorhersage wurden drei bioinformatische liganden- (SwissTargetPrediction) und strukturbasierte (@TOME, iRAISE) Methoden für das vielversprechendste Thiophen Thio-Iva eingesetzt. Korrelierte Ergebnisse (mit zusätzlichen Targets mit Relevanz für HCC) wurden mit einem radiometrischen Kinase-Aktivitätsassay (Eurofins KinaseProfilerTM) verifiziert. Um den Bindungsmodus und die Struktur-Aktivitäts-Beziehung der neuen Moleküle zu Thio-Ivas identifiziertem Haupt-Target VEGFR2 zu untersuchen, wurden Docking Studien (SeeSAR) durchgeführt. Für Thio-Iva wurden zusätzliche molekulardynamische Simulationen (Desmond) zur Verifikation der Bindungshypothese eingesetzt. Potentielle Toxizitäten und ADME-Eigenschaften der Moleküle wurden anhand des Thiophens Thio-Iva und des vielversprechendsten Brombenzols Briva mit prädiktiven bioinformatischen Webservern (eMolTox, SwissADME) untersucht. Zellkulturexperimente zur biologischen Validierung der beiden Moleküle Thio-Iva und Briva hinsichtlich Wachstumsinhibition (Kristallviolett-Assay), Apoptose (Caspase-3 Aktivitätsassay) und unspezifischer Toxizität (LDH-Freisetzungs-Assay) wurden an HCC-Zelllinen (HepG2, Huh-7) durchgeführt. Ergebnisse und Diskussion. Sechs der 43 Kinase-Targets, die für die in vitro Evaluierung ausgewählt wurden, zeigten eine Inhibition durch Thio-Iva von über 50% (VEGFR1, VEGFR2, Pim-1, Pim-2, CLK1 und c-Kit). Diese Ergebnisse weisen auf eine gewisse Selektivität, aber insbesondere auf eine hohe inhibitorische Aktivität von Thio-Iva gegen VEGFR2 (89% bei 10 µM) und VEGFR1 (75%) hin. Docking Studien mit VEGFR2 zeigten einen stabilen Bindungsmodus von Thio-Iva, mit einer Wasserstoffbrückenbindung and der wichtigen Hinge-Region von VEGFR2. Dieser Bindungsmodus blieb auch über eine molekulardynamische Simulation von 100 ns konsistent, was mit der beobachteten biologischen Aktivität an diesem Target übereinstimmt. Sowohl für Thio-Iva als auch für Briva wurden nur wenige toxische Eigenschaften vorhergesagt, was durch die geringe unspezifischen Toxizität in den eigenen Zellkultur-Untersuchungen ergänzt wurde. Zellkulturexperimente zeigten auch eine starke wachstumsinhibierende und Apoptose-induzierende Wirkung der beiden Moleküle in HCC Zelllinien. Insgesamt zeigten diese Ergebnisse, dass insbesondere Thio-Iva eine vielversprechende Leitstruktur für VEGFR2/Multikinase-Inhibitoren mit starker Antitumor-Wirkung darstellen könnte.
