Immunology cum grano salis: The effect of high salt on alternative and pro- inflammatory macrophage activation

Abstract

High intake of dietary salt (NaCl), characteristic of the “western” lifestyle, has been linked to hypertension, cardiovascular disease and autoimmunity. These diseases constitute an increasing social health burden and cause a high individual degree of suffering. Despite recent progress, our understanding of the underlying mechanisms remains incomplete. A modest, and physiological relevant, increase in extracellular salt was recently shown to have a pro- inflammatory effect and to boost the polarization of T helper 17 cells and classical, LPS-induced macrophages (M(LPS)) in vitro. High dietary salt intake translated to concordant effects in vivo, where experimental autoimmunity and clearance of infection were affected. This thesis examines how high salt affects the activation of non-inflammatory, alternative (M2) macrophages, and explores additional mechanisms by which salt affects M(LPS) cells. In stark contrast to Th17 and M(LPS) cells, high salt dose-dependently decreased the activation of IL-4+IL-13-stimulated (M(IL-4+IL-13)) bone marrow-derived murine macrophages. Genes important for M(IL-4+IL-13) activation and function, including Mrc1, Arg1, Ym1, Fizz1, PD-L2, Irf4 and Klf4 all had a blunted expression in the presence of high salt. This effect was not observed in tonicity control experiments with mannitol or urea, implying a specific action of NaCl. Importantly, this salt-blunted activation also translated to an effect on M2 function; in vitro, high salt decreased the ability of M(IL-4+IL-13) macrophages to suppress T cell proliferation. Moreover, mice fed a high salt diet had a reduced M2 activation in an IL-4-dependent in vivo activation model following chitin injection, and exhibited delayed wound healing compared with animals fed a normal salt diet. Different to recent findings with Th17 and M(LPS) cells, using genetic knock out models, the effect of salt on M(IL-4+IL-13) activation was mediated independently of signaling via Sgk1 or Nfat5. Genome-wide expression and histone modification analysis were employed (using microarray and ChIP-seq for H3K4me3 and H4ac, respectively) to explore the mechanisms by which high salt affected M(IL-4+IL-13) activation. By combining bioinformatics analysis of the genome- wide data with complementary in vitro experiments, high salt was found to reduce both mitochondrial metabolic output and glycolysis of M(IL-4+IL-13) macrophages. This was coupled with a blunting of Akt and mTOR signaling. Experimental restoration of Akt signaling, using a genetic constitutively active Akt model, rescued the effect of salt on M(IL-4+IL-13) activation. Taken together, these findings indicate a novel mechanism by which high salt reduces full M(IL-4+IL-13) macrophage activation via disturbed metabolic signaling pathways and the subsequent impairment of metabolic adaption. For M(LPS) macrophages, high salt was found to increase glycolytic flux which likely supports the metabolic changes normally associated with pro- inflammatory macrophage activation. Collectively, this thesis provides evidence that high salt reduced the activation of non-inflammatory innate immune cells and contributes to our understanding of the mechanisms by which salt may boost the activation of pro-inflammatory macrophages. It gives supports to the notion that high salt constitutes an important environmental factor, which has differential effects non-inflammatory versus pro- inflammatory immune cells, and may thereby contribute to the development of diseases associated with an imbalance of the immune system.

Die „westliche“ Lebensweise ist durch eine hohe Aufnahme von Kochsalz (NaCl) mit der Nahrung gekennzeichnet. Dies trägt maßgeblich zur Entwicklung von Bluthochdruck, kardiovaskulärer Komplikationen und Autoimmunerkrankungen bei. Diese Krankheitsbilder stellen persönlich und gesellschaftlich eine große Belastung dar. Trotz wesentlicher Fortschritte, versteht man die verantwortlichen Mechanismen bisher nur unvollständig. Vor kurzem konnte gezeigt werden, dass bereits eine geringe Erhöhung der extrazellulären Kochsalzkonzentration, wie sie auch physiologisch zu beobachten ist, in vitro zu einer signifikanten Aktivitätssteigerung von entzündlichen Th17 Zellen und von mit LPS aktivierten Makrophagen (M(LPS)) führt. Eine experimentelle Hochsalzdiät bestätigte diese Befunde in vivo: Salz verschlimmerte eine induzierte Autoimmunerkrankungen, währen es bei Ansteckung mit dem Protozoon L. major zu einer verbesserten Infektionsbekämpfung durch Makrophagen führte. Die vorliegende Doktorarbeit untersucht den Einfluss von Salz auf die Aktivierung nicht entzündlicher, sogenannter M2, Makrophagen. Im Gegensatz zu Th17 und M(LPS) Zellen wurde die M2 Aktivierung von Makrophagen, die aus Knochenmarksvorläuferzellen stammten, mit den Interleukinen IL-4+IL-13 (M(IL-4+IL-13)) durch Salz abgeschwächt. Der Effekt war dosisabhängig. Die Expression wichtiger M(IL-4+IL-13) Signaturgene, unter anderem Mrc1, Arg1, Ym1, Fizz1, PD-L2, Irf4 und Klf4, wurde durch Salz unterdrückt. Dies war kochsalzspezifisch und nicht allein auf eine erhöhte Tonizität der Umgebung zurückzuführen, wie durch Kontrollexperimente mit Mannit und Harnstoff gezeigt werden konnte. Auch verschiedene Zellfunktionen wurden durch Salz wesentlich beeinflusst: M(IL-4+IL-13) Zellen, die in der Gegenwart von Salz aktiviert wurden, unterdrückten die Proliferation von T Zellen in vitro deutlich schlechter. Außerdem wurde die Aktivierung von M2 Makrophagen in vivo in einem Chitininjektionsmodell durch Hochsalzdiät vermindert. Mäuse zeigten unter Hochsalzdiät ebenfalls eine verzögerte Wundheilung. Wie genetische Modelle zeigten, wirkte Salz im Gegensatz zu Th17 und M(LPS) unabhängig von Sgk1 oder Nfat5 auf die M(IL-4+IL-13) Aktivierung. Um den Wirkmechanismus aufzuklären, wurden die Genexpression und Histonmodifikationen (H3K4me3/H4ac) genomweit mit Microarray und ChIP-seq untersucht. Die kombinierte Analyse der genomweiten Daten und ergänzender in vitro Experimente ergab, dass Salz die mitochondriale und glykolytische Energiegewinnung von M(IL-4+IL-13) Makrophagen in Verbindung mit einer verringerten Aktivierung des Akt-mTOR Signalweges hemmt. Durch die experimentelle Überaktivierung desselben Signalweges wurde der Salzeffekt aufgehoben. Diese Befunde sprechen für einen neuen Mechanismus wie Salz die M2 Makrophagenaktivierung durch sein Eingreifen in metabolische Signalwege und die daraus resultierende gestörte metabolische Zellanpassung beeinflusst. Im Fall der M(LPS) Makrophagen erhöhte Salz die Glykolyse und damit die für entzündliche Immunzelltypen notwendige Anpassung des Zellstoffwechsels. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit eine verminderte Aktivierung von Zellen des angeborenen Immunsystems durch Salz und identifiziert bisher unbekannte Faktoren, die zur erhöhten Aktivierung entzündlicher Makrophagen durch Salz beitragen dürften. Damit trägt sie zu einem sich abzeichnenden Gesamtbild bei, in dem Salz einen wesentlichen Umweltfaktor für das Gleichgewicht des Immunsystems darstellt und so Gesundheit und Krankheit beeinflussen könnte.