Immunogenicity Studies Of The Yellow Fever Vaccine In Healthy Infants And Establishment Of Serological Diagnostic Tools For The Detection Of Yellow Fever Virus Infections

Abstract

Yellow fever (YF), an acute viral hemorrhagic fever caused by the yellow fever virus (YFV), is still one of the most feared diseases. YFV is a positive sense single-stranded enveloped RNA virus that belongs to the group of Flaviviruses and is transmitted to humans through the bite of infected mosquitoes. Primary endemic regions for YFV are sub-Saharan Africa and South America. YF counts as one of the neglected tropical diseases due to recurring outbreaks in the above-mentioned regions despite the availability of a safe and efficacious vaccine, i.e. YF-17D. The focus of this dissertation lay on the investigation of the efficacy of the YF-17D vaccine in infants and the development of two different serological assays for the detection of YFV infections. This resulted in three projects, of which the first project aimed at analyzing immunogenicity of the YF-17D vaccine in infants when administered concomitantly with the measles vaccine and a new meningococcal A conjugate vaccine (MenAfriVac, PsA-TT). The two clinical studies were conducted in Ghana and Mali among infants who received the meningococcal A conjugate vaccine (PsA-TT) concomitantly with Measles and YF vaccines at 9 months of age. YF neutralizing antibody titers were measured using a microneutralization assay. In both studies, the meningococcal A conjugate vaccine did not adversely affect the immune response to the concomitantly administered YF vaccine at the age of 9 months. The magnitude of the immune response was different between the two studies, with higher seroconversion and seroprotection rates found in Mali when compared to Ghana. Therefore, further studies are warranted to better understand the determinants of the immune response to YF vaccine in infancy. In order to further investigate these serum samples, the second project dealt with the establishment of an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of YF IgG and IgM antibodies. Till date the gold standard in serodiagnosis is the plaque reduction neutralization assay. This assay however, is time consuming and laborious. Therefore, rapid and specific diagnostic tests for the serological analysis of serum samples are of immense importance - especially when considering the increasing numbers of yellow fever cases in recent years. The newly established indirect YF IgG/IgM ELISA would allow a much faster and easier analysis of multiple serum samples at the same time. An indirect ELISA based on the recombinant NS1 protein was successfully developed. With this newly established indirect ELISA 190 serum samples, which have been obtained from the above mentioned clinical studies, were analyzed in regard to IgM and IgG antibodies against YFV. In addition, a third project was defined, which dealt with the execution of different virological methods used in YFV diagnosis as well as the evaluation of the subsequent results on a new system for real time analysis of cell proliferation with cell impedance measurements (Roche xCELLigence™ system). Therefore, standard virological YFV protocols have been transferred and established on to this novel system. Furthermore, two different published mathematical models for the quantification of YF neutralizing antibodies in serum samples have been compared. All the standard virological methods used in YFV diagnosis could be successfully transferred on to this new system. Moreover, both neutralizing antibody determination strategies could be applied on serum samples with known YFV neutralizing antibody titers. However, both strategies show weaknesses due to which further testing with more samples is required.

Gelbfieber (GF) gehört aktuell zu den am meisten gefürchteten, durch Mücken übertragenen Krankheiten. Ursache dieser Erkrankung ist das Gelbfiebervirus (GFV), welches endemisch in Subsahara-Afrika und in Süd-Amerika auftritt. GF gilt als vernachlässigte tropische Krankheit, denn obwohl es den sicheren und effizienten Impfstoff GF-17D gibt, treten wiederholt zahlreiche Ausbrüche in den oben genannten Regionen auf. Diese Dissertation beschäftigt sich mit der Untersuchung der Effizienz des GF-17D Impfstoffs in Säuglingen und der Entwicklung zweier serologischer Tests zur Detektion von GFV Infektionen. Hieraus ergaben sich drei Projekte, wobei sich das erste Projekt mit der Untersuchung der Immunogenität des GF-17D Impfstoffs in Säuglingen beschäftigt, wenn dieses zusammen mit dem Masern- und einem neuen Meningokokken - Meningitis A - Konjugat Impfstoff (PsA-TT, MenAfriVac) verabreicht wird. Grundlage waren zwei klinische Studien, wobei 190 neun Monate alte Säuglinge in Ghana und Mali gleichzeitig die Meningokokken- Meningitis A (PsA-TT), Masern- und GF-Impfungen erhielten. GF-neutralisierende Antikörper wurden mittels eines Mikroneutralisationstests detektiert. In beiden Studien konnte gezeigt werden, dass bei einer gleichzeitigen Verabreichung die Immunantwort des GF-17D Impfstoffs in 9 Monate alten Säuglingen nicht durch den PsA-TT Impfstoff beeinträchtigt wurde. Die Intensität der Immunantwort war zwischen den beiden Studien unterschiedlich. Serokonversions- und Seroprotektionsraten waren in Mali höher als in Ghana. Dies macht weitere Studien notwendig, um die genauen Determinanten der Immunantwort nach einer GF-Impfung im Kindesalter zu verstehen. Das zweite Projekt fokussierte sich auf die Etablierung eines indirekten Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA) zur Detektion von GF-IgG und -IgM Antikörpern in den beschriebenen Seren von 9 Monate alten Säuglingen. Bis heute ist der Plaque Reduktions-Neutralisationstest (PRNT) der Goldstandard der Serodiagnostik, welcher jedoch sehr zeitaufwendig und mühsam in der Ausführung ist. Schnelle, spezifische Tests zur serologischen Untersuchung von Serum- Proben sind von enormer Wichtigkeit, insbesondere angesichts der steigenden Zahlen an GF-Erkrankungen in den letzten Jahren. Wir konnten erfolgreich einen indirekten ELISA entwickeln und etablieren. Dieser neu etablierte indirekte ELISA basiert auf dem rekombinanten NS1 Protein und erlaubt eine deutlich schnellere und leichtere Analyse von multiplen Serum-Proben. Die 190 Serum- Proben aus den oben beschriebenen Studien konnten erfolgreich mit dem neu etablierten ELISA auf GF-IgG und -IgM Antikörper analysiert werden. Zusätzlich wurde ein drittes Projekt formuliert, welches sich mit der Ausführung von verschiedenen virologischen Methoden der GFV Diagnostik sowie der Auswertung von den daraus resultierenden Ergebnissen auf einem neuartigen System zur Echtzeit-Analyse der Zellproliferation mit Impedanz-Messung (Roche xCELLigence™ system) beschäftigt. Dafür wurden standardisierte virologische Protokolle auf dieses neuartige System übertragen und unter Berücksichtigung der dort geltenden spezifischen Anforderungen etabliert. Zusätzlich wurden zwei publizierte mathematische Modelle zur Quantifizierung von GF neutralisierenden Antikörpern miteinander verglichen. Ergebnis dieses Teilprojektes war die erfolgreiche Übertragung aller Standard-Protokolle der GF Diagnostik auf das xCELLigence™-System und eine erste Untersuchung einer geringen Anzahl von Seren. Beide mathematischen Modelle konnten zur Quantifizierung von neutralisierenden Antikörpern gegen das GFV angewandt werden. Dies ermöglicht nach weiterer Optimierung der Parameter eine neuartige und schnelle Analyse weiterer Proben aus zukünftigen Studien.