Equine herpesvirus type 1: immune evasion and vector development

Abstract

Equine herpesvirus type 1 (EHV-1) remains a severe threat to horse industry despite widespread vaccination. The control of EHV-1 infection is mainly dependent on cellular immunity that is mediated by CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs). EHV-1, as its relatives in the large Herpesviridae family, has evolved strategies to evade CTL immunity by interfering with the major histocompatibility complex class I (MHC-I) antigen presentation pathway. In the first part of this thesis, we identified a novel immunomodulatory protein involved in the downregulation of MHC-I from the cell surface. The responsible viral protein, pUL56, which is encoded by EHV-1 open reading frame 1 (ORF1), is a phosphorylated early protein, which is expressed as different forms and predominantly localizes to Golgi-derived membranes. In addition, the transmembrane (TM) domain of pUL56 was shown to be indispensable for correct subcellular localization and proper function. The function of pUL56 was independent of that mediated by pUL49.5, a viral protein known to inhibit the transporter associated with antigen processing (TAP) and encoded by EHV-1 and related viruses. Surprisingly, pUL56 by itself was not capable of downregulating MHC-I and likely needs (an)other unidentified viral protein(s) to perform this action. EHV-1 has recently been demonstrated to be a promising viral vehicle for delivery of foreign antigens. In the second part of the thesis, we utilized ORF1 as the locus for the insertion of foreign genes, more specifically the VP2 and/or VP5 genes of bluetongue virus serotype 8 (BTV-8). BTV-8 can infect most domestic and wild ruminants species and was responsible for an epizootic in northern Europe in 2006. The EHV-1 recombinant viruses generated stably expressed the transgenes and grew with kinetics that were identical to those of parental virus in vitro. After immunization of mice, a BTV-8-specific neutralizing antibody response was elicited. In a challenge experiment using a lethal dose of BTV-8, 100% of interferonreceptor- deficient (IFNAR-/-) mice vaccinated with the recombinant EHV-1 carrying both VP2 and VP5, but not VP2 alone, survived. VP7 was not included in the vectored vaccines and was successfully used as a marker for differentiating infected from vaccinated animals (DIVA). In conclusion, EHV-1 ORF1-encoded pUL56 is a novel immune evasion protein involved in the interference of MHC-I surface expression, but is unable to perform its function outside of the context of viral infection. An EHV-I recombinant carrying VP2 and VP5 of BTV-8 in the ORF1 locus is capable of eliciting protective immunity in a murine infection model and as such may be an alternative for BTV vaccination strategies.

Das equine Herpesvirus 1 (EHV-1) ist, trotz routinemäßiger Impfung, auch heutzutage ein großes Problem in der Pferdehaltung. EHV-1-Infektionen werden hauptsächlich durch die zelluläre Immunantwort kontrolliert, getragen durch CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (cytotoxic T lymphocytes, CTL). EHV-1, wie auch weitere Vertreter der großen Herpesviridae-Familie, hat Strategien entwickelt, diese CTL-vermittelte Immunantwort zu umgehen, indem es die Antigenpräsentation durch den Hauptgewebeverträglichkeitskomplex Klasse I (major histocompatibility complex class I, MHC-I) stört. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde ein immunmodulatorisches Protein identifiziert, welches an der Unterdrückung der MHC-I-Lokalisierung an der Zellmembran beteiligt ist. Das verantwortliche virale Protein pUL56, kodiert im offenen Leserahmen (open reading frame, ORF) EHV-1 ORF1, ist ein phosphoryliertes frühes Protein, mit unterschiedlichen Translationsvarianten, das vornehmlich an Membranen des Golgi-Apparates und davon gebildeten Vesikeln lokalisiert ist. Außerdem wurde gezeigt, daß die Transmembrandomäne von pUL56 essentiell für die korrekte Funktionalität und subzelluläre Lokalisierung des Proteins ist. Unabhängig davon wird die Funktion von pUL56 auch von pUL49.5 vermittelt, einem viralen Protein, das den Transporter der Antigenprozessierung (TAP) inhibiert und von EHV-1 und verwandten Viren kodiert wird. Überraschenderweise ist pUL56 allein nicht in der Lage, MHC-I herunterzuregulieren, daher benötigt es wahrscheinlich weitere, bisher unidentifizierte, virale Proteine für diese Funktion. EHV-1 ist, wie kürzlich demonstriert, ein vielversprechender viraler Vektor für fremde Antigene. Im zweiten Teil dieser Doktorarbeit wurde der ORF1-Genort benutzt, um dort fremde Gene einzufügen, spezifisch die VP2- und/oder VP5-Gene des Blauzungenkrankheitvirus (blue tongue virus, BTV) Serotyp 8. BTV-8 infiziert die meisten domestizierten und freilebenden Wiederkäuer und war für einen Seuchenausbruch in Nordeuropa 2008 verantwortlich. Die konstruierten EHV-1-Rekombinanten exprimieren stabil die entsprechenden Transgene und zeigen mit dem Wildtyp identische Wachstumskurven in vitro. Immunisierung von Mäusen mit transgenem Virus führte zur Bildung BTV-8-spezifischer Antikörper. In einem Infektionsversuch mit einer tödlichen Dosis BTV-8 an Interferon-A-Rezeptor-defizienten (IFNAR-/-) Mäusen überlebten 100% der mit VP2/VP5-doppelttransgenem EHV-1 geimpften Tiere, aber keines der mit VP2- einfachtransgenem EHV-1 geimpften. VP7 wurde in den transgenen Impfstoffen nicht verwendet und ist erfolgreich als Unterscheidungsmerkmal infizierter und geimpfter Tiere (marker for differentiating infected from vaccinated animals, DIVA) benutzt worden. Zusammengefaßt kann gesagt werden, daß das vom EHV-1 ORF1 kodierte Protein pUL56 ein bisher unbekannter Faktor ist, mit dem das Virus der Immunantwort ausweicht. pUL56 ist an der Störung der MHC-I-Oberflächenexpression beteiligt, kann aber seine Funktion nicht außerhalb des viralen Kontextes ausüben. Ein rekombinantes EHV-1, das VP2 und VP5 vom BTV-8 im ORF1-Genort trägt, löst im Mausmodell protektive Immunität aus und kann daher eine mögliche Alternative zu bisherigen BTV-8-Impfstrategien sein.