Characterization of the Role of Histone Deacetylase 7 in CD8+ T Cell Dependent Anti-tumor Immune Responses and T Cell Homeostasis

Abstract

CD8+ T cells represent an essential component of anti-tumor immune responses by mediating direct cytotoxicity against neoplastic cells as well as by providing immunological memory. The activation of CD8+ T cells by tumor-specific or tumor-associated antigens results in their rapid expansion and differentiation into effector cytotoxic cells (CTL). Once target tumor cells are eradicated, the population of effector CTLs contracts and leaves behind a small population of long-lived memory cells. However, the immunosuppressive nature of the tumor microenvironment and sustained antigen exposure commonly drive tumor-infiltrating CTLs into a hypo-responsive and so called “exhausted” state which is characterized by defective cytotoxicity and impaired production of anti-neoplastic cytokines such as TNF and IFN. This exhausted phenotype of tumor-specific CD8+ T cells is furthermore marked by an increased expression of co-inhibitory molecules such as PD-1 and Tim-3, which deter the activation and function of CD8+ T cells contributing to the immune evasion of tumor cells. The exhaustion of tumor-specific T cells thereby not only affects endogenous CD8+ T cells but also compromises the success of immunotherapies such as the adoptive transfer of CD8+ T cell or CAR T cell therapies as transferred T cells become frequently exhausted and dysfunctional. Therefore, it is crucial to better understand the molecular regulators of CD8+ T cell function and exhaustion to overcome the limitations of current CD8+ T cell-based immunotherapies. Similarly, we believe that a better characterization of new molecular regulators of CD8+ T cell exhaustion will allow to develop more potent immunotherapies against human tumors that are so far not sufficiently treated by current adoptive T cell therapies. HDACs are among the key epigenetic orchestrators of gene regulation. They catalyze the removal of acetyl groups from histone tails resulting in chromatin condensation and suppression of gene expression. As a class IIa HDAC, HDAC7 can shuttle from the nucleus to the cytoplasm depending on its phosphorylation status. Therefore, HDAC7 represents a regulator of both nuclear and cytoplasmic proteins with diverse functions and HDAC7 was found to play a critical role during the thymic development of T cells by regulating T cell apoptosis and their positive selection. Although the role of HDAC7 in T cell development is well understood, very little is known about its role in peripheral adult T cells, especially in the context of anti-tumor immunity. In this PhD project, we hypothesized that HDAC7 might also play a central role during CD8+ T cell-mediated anti-tumor responses of CD8+ T cells, in which sustained exposure of CD8+ T cells to TAA and TSA hamper the metabolic fitness and the functional capacity of CD8+ T cells. To investigate the role of HDAC7 in the anti-tumor immune responses of CD8+ T cells, we used conditional mouse models with T cell specific deletion of Hdac7. In line with the previous findings from our group, we could show that HDAC7fl/flE8I-Cre mice display a pre-activated phenotype as there is a significant reduction in the frequency of naïve CD8+ T cells compared to wild type (wt) littermates. We also observed that HDAC7 is the main class II HDAC expressed in CD8+ T cells during their in vitro differentiation into CTL. In addition, the deletion of Hdac7 in CD8+ T cells led to a growth defect in vitro due to increased apoptosis. We showed that the increased apoptosis in Hdac7-deficient CD8+ T cells was at least partially caused by increased MEF2D-driven FasL expression. Moreover, CD8+ T cells lacking HDAC7 displayed deterred calcium homeostasis, mTOR signaling as well as augmented amino acid metabolism suggesting that they have an impaired anti-tumor immune response. Indeed, Hdac7fl/flCD4-Cre and HDAC7fl/flE8I-Cre mice could not control tumor growth upon challenge with lymphoma cells supporting that HDAC7 is a crucial factor for the proper anti-tumor immune functions of CD8+ T cells. Moreover, tumors from Hdac7fl/flCD4-Cre mice had reduced infiltration of CD8+ T cells which resulted from an impaired expansion of CD8+ T cells in vivo, but not from a homing defect as assessed by adoptive T cell transfer experiments in mice. Interestingly, the adoptive transfer of in vitro differentiated tumor-antigen-specific CTLs could rescue the phenotype of Hdac7fl/flCD4-Cre mice. Furthermore, tumor infiltrating Hdac7-deficient CTLs had elevated frequency of PD1+Tim3+ population pointing to a role of HDAC7 in the exhaustion of CD8+ T cells during chronic antigen exposure. Additionally, the analysis of our RNA-seq data, published scRNA-seq data as well as in vitro T cell exhaustion models that we have established confirmed the role of HDAC7 in the exhaustion of CD8+ T cells. In summary, we here identified HDAC7 as a key regulator of CD8+ T cell-based anti-tumor immune responses since the lack of Hdac7 impaired the survival, metabolism as well as the fitness of CD8+ T cells by increased exhaustion within the immunosuppressive tumor microenvironment. We propose that our findings are not only clinically relevant to highlight the possible side effects of HDAC inhibitors, but are also important for the design and the development of novel HDAC inhibitors to treat inflammatory and neoplastic diseases.

CD8+ T-Zellen stellen eine essentielle Komponente der anti-Tumor-Immunantwort dar, indem sie sowohl direkte Zytotoxizität gegen neoplastische Zellen vermitteln, als auch ein immunologisches Gedächtnis bereitstellen. Die Aktivierung von CD8+ T-Zellen durch tumorspezifische oder tumorassoziierte Antigene führt zu ihrer schnellen Expansion und Differenzierung in zytotoxische Effektorzellen (CTL). Sobald die Zieltumorzellen eliminiert sind, verkleinert sich die Population der Effektor-CTLs und hinterlässt eine kleine Population von langlebigen Gedächtniszellen. Die immunsuppressive Natur des Tumormilieus und die anhaltende Antigenexposition treiben die tumorinfiltrierenden CTLs jedoch häufig in einen hyporesponsiven und so genannten "erschöpften" Zustand, der durch defekte Zytotoxizität und beeinträchtigte Produktion von anti-neoplastischen Zytokinen wie TNF und IFN gekennzeichnet ist. Dieser erschöpfte Phänotyp tumorspezifischer CD8+ T-Zellen ist darüber hinaus durch eine erhöhte Expression ko-inhibitorischer Moleküle wie PD-1 und Tim 3 gekennzeichnet, die die Aktivierung und Funktion von CD8+ T-Zellen verhindern und so zur Immunevasion von Tumorzellen beitragen. Die Erschöpfung tumorspezifischer T-Zellen beeinträchtigt dabei nicht nur die endogenen CD8+ T-Zellen, sondern gefährdet auch den Erfolg von Immuntherapien wie dem adoptiven Transfer von CD8+ T-Zellen oder CAR T-Zell-Therapien, da übertragene T-Zellen häufig erschöpft und dysfunktional werden. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die molekularen Regulatoren der CD8+ T-Zell-Funktion und -Erschöpfung besser zu verstehen, um die Grenzen der derzeitigen CD8+ T-Zell-basierten Immuntherapien zu überwinden. Daher kann nur eine bessere Charakterisierung neuer molekularer Regulatoren der CD8+ T-Zell-Erschöpfung die Entwicklung potenterer Immuntherapien gegen humane Tumore ermöglichen, die bisher durch aktuelle adoptive T-Zell-Therapien nicht ausreichend behandelt werden. Histondeacetylasen (HDAC) nehmen eine zentrale Funktion in der epigenetischen Genregulation ein. Sie katalysieren die Entfernung von Acetylgruppen von Histonen, was zur Chromatinkondensation und Unterdrückung der Genexpression führt. Als Klasse-IIa-HDAC kann HDAC7 je nach Phosphorylierungsstatus vom Zellkern ins Zytoplasma wandern. Daher stellt HDAC7 einen Regulator von sowohl nukleären als auch zytoplasmatischen Proteinen mit vielfältigen Funktionen dar. Es wurde festgestellt, dass HDAC7 eine kritische Rolle während der thymischen Entwicklung von T-Zellen spielt, indem es die Apoptose von T-Zellen und deren positive Selektion reguliert. Obwohl die Rolle von HDAC7 in der T-Zell-Entwicklung gut verstanden ist, ist sehr wenig über seine Rolle in peripheren adulten T-Zellen bekannt, insbesondere im Kontext der anti-Tumor-Immunität. In diesem Promotionsprojekt stellten wir die Hypothese auf, dass HDAC7 eine zentrale Rolle während der CD8+ T-Zell-vermittelten anti-Tumor-Antwort spielen könnte, bei der eine anhaltende Exposition von CD8+ T-Zellen gegenüber Tumor-assoziierten Antigenen und Trichostatin A die metabolische Fitness und die funktionelle Kapazität von CD8+ T-Zellen beeinträchtigt. Um die Rolle von HDAC7 bei der anti-Tumor-Immunantwort von CD8+ T-Zellen zu untersuchen, haben wir konditionale Mausmodelle mit T-Zell-spezifischer Deletion von HDAC7 verwendet. In Übereinstimmung mit den früheren Ergebnissen unserer Gruppe konnten wir zeigen, dass HDAC7fl/flE8I-Cre-Mäuse einen voraktivierten Phänotyp aufweisen, da die Häufigkeit naiver CD8+ T-Zellen im Vergleich zu Wildtypmäusen aus demselben Wurf- signifikant reduziert ist. Wir beobachteten auch, dass HDAC7 die wichtigste Klasse-II-HDAC ist, die in CD8+ T-Zellen während ihrer in vitro-Differenzierung zu CTL exprimiert wird, und dass die Deletion von HDAC7 in CD8+ T-Zellen zu einem Wachstumsdefekt in vitro aufgrund von erhöhter Apoptose führt. Wir konnten zeigen, dass die erhöhte Apoptose in HDAC7-defizienten CD8+ T-Zellen zumindest teilweise durch eine erhöhte MEF2D-getriebene FasL-Expression verursacht wurde. Darüber hinaus zeigten CD8+ T-Zellen, denen HDAC7 fehlte sowohl eine gestörte Kalzium-Homöostase als auch mTOR-Signalweg sowie einen erhöhten Aminosäuren-Stoffwechsel, was darauf hindeutet, dass sie eine beeinträchtigte anti-Tumor-Immunantwort haben könnten. Tatsächlich konnten Hdac7fl/flCD4-Cre- und HDAC7fl/flE8I-Cre-Mäuse das Tumorwachstum nach einer Provokation mit Lymphomzellen nicht kontrollieren, was darauf hindeutet, dass HDAC7 ein entscheidender Faktor für die effektive anti-Tumor-Immunfunktionen von CD8+ T-Zellen ist. Darüber hinaus wiesen Tumore von Hdac7fl/flCD4-Cre-Mäusen eine reduzierte Infiltration von CD8+ T-Zellen auf, was aus einer beeinträchtigten Expansion von CD8+ T-Zellen in vivo resultierte, aber nicht aus einem Homing-Defekt, wie durch adoptive T-Zell-Transfer-Experimente in Mäusen festgestellt wurde. Interessanterweise konnte der adoptive Transfer von in vitro differenzierten tumorantigenspezifischen CTLs den Phänotyp von Hdac7fl/flCD4-Cre-Mäusen retten. Darüber hinaus wiesen tumorinfiltrierende HDAC7-defiziente CTLs eine erhöhte Frequenz von PD 1+Tim-3+-Populationen auf, was auf eine Rolle von HDAC7 bei der Erschöpfung von CD8+ T-Zellen während chronischer Antigenexposition hinweist. Darüber hinaus bestätigte die Analyse unserer RNA-seq-Daten, publizierte scRNA-seq-Daten sowie die von uns etablierten in vitro T-Zell-Erschöpfungsmodelle die Rolle von HDAC7 bei der Erschöpfung von CD8+ T-Zellen. Zusammenfassend haben wir hier HDAC7 als einen Schlüsselregulator von CD8+ T-Zell-basierten anti-Tumor-Immunantworten identifiziert, da das Fehlen von HDAC7 das Überleben, den Stoffwechsel sowie die Fitness von CD8+ T-Zellen beeinträchtigt. Wir schlagen vor, dass unsere Ergebnisse nicht nur klinisch relevant sind, da sie auf mögliche Nebenwirkungen von HDAC-Inhibitoren hinweisen, sondern auch wichtig für die Entwicklung von neuartigen HDAC-Inhibitoren zur Behandlung von entzündlichen und neoplastischen Erkrankungen.